Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Logo1me Základy genomiky IV. Přístupy reverzní a přímé genetiky Genetika přímá Jan Hejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Genomika III. Přístupy genetiky přímé §Přímá vs. reverzní genetika Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me „Přímě genetický“přístup 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně genetický“ přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM NÁHODNÁ MUTAGENEZE arab Přístupy „klasické“genetiky versus „reversně genetický“ přístup ve funkční genomice Arabidopsis thaliana EMS T-DNA (retro)transposons Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika III. Přístupy genetiky přímé ¨anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Infekce EμMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé §Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze § Genomika III. Přístupy genetiky přímé §Infekce EμMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které obsahují ve 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2 §Infekce EμMyc dvojnásobných mutantů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních partnerů Pim proteinů, paralelní dráhy (Y) nebo k aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z) Mikkers et al., Nature Gen (2002) ? Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Štěpení genomové DNA a ligace speciálních linkerů, tzv. splinkerett (zvýšení specificity amplifikace) §Izolace genomových oblastí přílehajících k místu inzerce proviru § Genomika III. Přístupy genetiky přímé §První amplifikace pomocí specifických primerů §Druhá amplifikace pomocí „nested“ primerů (zvýšení specificity) Mikkers et al., Nature Gen (2002) §Lokalizace oblastí přiléhajících k protoviru vyhledáváním v anotovaných databázích myšího genomu Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika III. Přístupy genetiky přímé ¨vnějšího fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů §Metabolické profilování rostlin Genomika IV. Přístupy genetiky přímé-metabolomika a metabolické profilování §identifikace (např. i komerčně) zajímavých mutantů §snadná a rychlá izolace genů pomocí identifikace T-DNA zasažených sekvenci tof-ms GC_MS_metabolomics GC_MS_metabolomics_3 tc_bioanalytics tc_screening tc_bioinformatics §možnost využít i speciální techniky, např. mikrodisekce vasc_bundles_prof GC_MS_metabolomics_2 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé ¨fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů a molekulárních markerů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me gus6__1_1g1_34__30_318 §analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese §Identifikace mutantů se změnou expresního profilu Genomika IV. Identifikace mutantů se změnou expresního profilu immuno_2 insitu ? dotslide3_1 dotslide3_5 §možnost částečné automatizace (virtuální digitální mikroskopie) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me P1010006 P1010011 .slide microscope Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Image_115 01 rodic 27 obr27 41 41-1 Image_127 Genomika IV. Identifikace mutantů se změnou expresního profilu WT Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé ¨fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me fig2 Identifikace mutantního fenotypu §zvlněné listy §chybějící trychomy na listech a na stonku §opožděné stárnutí §keříčkovitý fenotyp (poruchy větvení) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me fig The Mutant Phenotype Identification §Samčí sterilita, poruchy v prodlužování tyčinek (A,B) (porovnej se standardním typem C) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze §identifikace T-DNA mutované oblasti Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mutant Locus Identification 1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici pomocí plasmid rescue fig4 §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §religace a transformace §izolace plazmidové DNA z pozitivně selektovaných klonů §identifikovaná sekvence je identická s genem pro NAD7 kódovaným na mtDNA Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mutant Locus Identification 2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici pomocí inverzní PCR (iPCR) §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §purifikace, religace a PCR pomocí T-DNA specifických primerů §klonování a sekvencování RB_flank_map §identifikovaná sekvence nebyla homologní k žádné sekvencí se známou funkcí Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze §identifikace T-DNA mutované oblasti §lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me IGF_BAC Vyhledávání v knihovně IGF-BAC §genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí inzertu 100 kb §bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách § §knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s radioaktivně značenou sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me I. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA § celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů § 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2 § 18 s podobností k mtDNA II. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA § celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů § všechny lokalizovány na chromozomu 2 Mapování pomocí IGF-BAC databáze Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me chrom_local Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé hranici T-DNA na chromozomu 2 Sekvence přiléhající k pravé a levé hranici T-DNA inversion §pravděpodobně došlo k inverzi téměř celého chromozómu Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨vnějšího fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Poziční klonování Genomika IV. Přístupy genetiky přímé-fragmentační analýza a poziční (map-based) klonování §podstatou je kosegregační analýza segregující populace (většinou potomstva informativního zpětného křížení) s molekulárními markery ¨RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ¨RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ¨AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ¨SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) ¨polymorfizmus délky genomu (PCR produktů) amplifikovaného pomocí specifických primerů ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu, detekce pomocí Southern blotu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨polymorfizmus délky náhodně (pomocí krátkých primerů, 8-10 bp) amplifikovaných úseků genomu ¨polymorfizmus délky fragmentů genomu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu amplifikovaných pomocí PCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me M M m m Col Ler M M m m Ler Ler m m M M Col Col m + M M Col Ler + M Col Ler m M m M + M Ler Ler + M + M Ler Ler + + M M Col Col Col Ler + M + M + + M M ♂ Ler Ler ♀ Col Col m m M M m + Col Ler Příprava mapovací populace Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Rekombinantní analýza – určení procenta rekombinace mezi mutací a molekulárním markerem r [%] = počet chomozomů Col / počet všech chromozomů x 100 marker I – ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II - žádná vazba 6 mutantů 7/12x100 = 58% •Analýza cca 2000 mutantních linií •Určení nejbližšího (ještě) segregujícího markeru •Identifikace mutace pomocí sekvenování Ler Col Ler Col Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mapa DNA molekulárních markerů Mapa Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Markery pro jemné mapování Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV.-shrnutí Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨vnějšího fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Genomika IV. Diskuse