Samčí gametofyt mikrosporogeneze mikrogametogeneze SE micrograph of an early floral developmental stage Photo: C. J. Runions Cornell University Am. J. Bot. Clarkia xantania (Onagraceae)‫‏‬ blizna s čnělkou http://www.botany.org/pl antimages větší prašníky menší prašníky petaly sepaly s trichomy Samčí rozmnožovací orgán = tyčinka soubor tyčinek = androeceum • tyčinka se zakládá jako meristematický hrbolek laterálně na vrcholu květního základu • z baze nitka (filamentum) • z apexu prašník (anthera) prašný váček prašný váček konektiv (spojidlo)‫‏‬ prašné pouzdro prašné pouzdro prašné pouzdro prašné pouzdro Stavba prašníku • exothecium = pokožková vrstva s kutikulou stomium, hypostomium • endothecium = subepidermální, vláknitá vrstva • střední vrstva = mezofyl, parenchymatické pletivo • tapetum = výstelka prašného pouzdra – žlaznaté (sekretorické) – ameboidní = periplazmodium Vývoj buněk tapeta • vnější a vnitřní tapetum – má dvojí původ • předmitotická fáze - buňky jednojaderné meristematické • mitotická fáze – mitóza bez cytokineze + endomitóza = 2 polyploidní jádra, zvětšuje se i objem buněk • postmitotická fáze – vesikulární útvary = vysoká syntetická a sekreční aktivita • programovaná buněčná smrt buněk tapeta prašný váček prašné pouzdro tetrády tapetum exothecium endothecium mezofyl konektiv s CS nitka prašný váček stomium Řez prašníkem lilie Mikrosporogeneze vývoj mikrospor ze sporogenních buněk subepidermální buňky meristem. hrbolku primární archespor sporogenní buňky mikrosporocyty pylové mateřské buňky (PMC)‫‏‬ tetrády mikrospor mikrospory redukční meiotické dělení kaláza Typy tetrád sukcesivní typ - ihned po I. meiotickém dělení vzniká centrifugálně přehrádka (diáda mikrospor) a po II. meiotickém dělení tetráda (častý u jednoděložných rostlin)‫‏‬ simultánní typ - po I. meiotickém dělení přehrádka nevzniká, teprve po skončení II. meiotického dělení začíná centripetálně (od periferie dovnitř) tvorba brázd a následně přepážek (typický u dvouděložných rostlin) Mikrogametogeneze = vývoj samčích gamet mikrospory pylová zrna dvoubuněčná (Liliaceae, Rosaceae, Solanaceae - tabák)‫‏‬ pylová zrna tříbuněčná (Brassicaceae - Arabidopsis, Asteraceae, Poaceae)‫‏‬ mitóza 1x 2x 30% z 200030% z 2000 analyzovananalyzovanýých druhch druhůů Funkce tapeta • produkce enzymu kalázy (β−D−1,3-glukanáza) rozkládá kalózu a uvolňuje mikrospory z tetrád) • syntéza prekurzorů exiny • syntéza a vylučování pylového tmelu (depozice na povrchu pylových zrn) • syntéza proteinů (depozice ve vnější vrstvě pylových zrn - exině) Meióza = redukční dělení I. heterotypické dělení - redukční segregace homologních chromosomů • profáze • leptoten • zygoten - bivalenty • pachyten • diploten – chiasmata, CO • diakineze • metafáze • anafáze • telofáze interfáze mezi I. a II. dělením je krátká (nedochází k syntéze DNA) II. homeotypické dělení = ekvační – dochází k segregaci alel průběh je shodný s mitózou profáze II. bezprostředně navazuje na telofázi I. nezralá stěna vakuola Meióza I a II kaláza 1. mitóza jádro veget. buňky jádro generat. buňky odvodnění pylová mateřská buňka tetráda volné mikrospory mikrospora nezralé pylové zrno zralé pylové zrno klíčící pylové zrno 2. mitóza migrace jádra apertura dozrávání tvorba mikrospor tvorba gamet kalózová stěna spermat. buňky pylová láčka jádro schéma vývoje dvoubuněčného pylu Sporoderma - stěna pylového zrna intina = pektocelulózová – spojení intiny s okolním prostředím = apertury (póry), někdy i kanálky exina = sporopolenin = velmi rezistentní polymer lipidické povahy – endexina = hladká lamelární vrstva – ektexina = strukturovaná: základní vrstva bakuly tektum pylový tmel – na povrchu exiny: lipidy, proteiny, flavonoidy, aromatické látky Stavba exiny pylového zrna pelyňku (Artemisia) tektum bakuly základní vrstva sporopolenin ektexina endexina lamelární vrstva Hydratovaná pylová zrna lilie Foto: G. Obermeyer Mikrosporogeneze u Lilium IASPRR International Society for Sexual Plant Reproduction Research http://images.iasprr.org/lily/ Mikrosporocyty v rané profázi I. většinu profáze I představuje precizní párování homologních chromosomů tapetum exothecium endothecium mezofyl stomium IASPRR Mikrosporocyty v rané profázi I. detail IASPRR Střed profáze I. pachytene - chromosomy jsou velmi prodloužené, spárované homologní chromosomy vyměňují genetický materiál IASPRR Pozdní profáze I. pokračuje kondenzace homologních chromosomů - blíží se diakinese tapetum exothecium endothecium mezofyl stomium IASPRR detail předchozího snímku Pozdní profáze I. IASPRR Diakinesis diakineze = poslední stadium profáze I před metafází tapetum exothecium endothecium mezofyl IASPRR Diakinesis IASPRR Metafáze I. metafázní chromosomy IASPRR Anafáze I. homologní chromosomy přemístěné na opačné buněčné póly = přesné dělení genetického materiálu IASPRR Telofáze I. výrazná buněčná přepážka se tvoří mezi jádry po I. meiotickém dělení u lilie (diády), druhé meiotické dělení probíhá rychle tapetum exothecium endothecium mezofyl IASPRR Telofáze I. diády IASPRR Metafáze II. separace chromatid během II. meiotického dělení tapetum exothecium endothecium mezofyl IASPRR Metafáze II. detail tapetum IASPRR Cytokineze tetrád. Separace buněk začíná brzy od stěny mikrosporocytu. Telofáze II. tapetum IASPRR Tetrády v "callose special wall" Kalóza tvoří obal tetrád uvnitř staré stěny mikrosporocytu. Mikrospory se oddělují od stěny mikrosporocytu, zakulacují se a tvoří primexinu = prekursor templátu pro pozdější ukládání exiny. tapetum IASPRR Kalóza tvoří obal tetrád uvnitř staré stěny mikrosporocytu. Mikrospory se oddělují od stěny mikrosporocytu, zakulacují se a tvoří primexinu = prekursor templátu pro pozdější ukládání exiny. Tetrády v "callose special wall" tapetum IASPRR Tetrády mikrospor dokončování tvorby tetrád mikrospor – jejich prodlužování IASPRR As microspores complete this stage, they elongate somewhat, becoming a bit football shaped Tetrády mikrospor tapetum IASPRR Mikrospory uvolněné z tetrád mikrospory mají již exinu (vnější stěna tvořená sporopoleninem), plní se zásobními materiály a zůstávají po krátké období pružné IASPRR Mikrospory uvolněné z tetrád mikrospory mají vytvořenou exinu (vnější stěna tvořená sporopoleninem) tapetum IASPRR Mikrogametogeneze u Lilium IASPRR Dvoubuněčný pyl Generativní buňky se tvoří zpočátku v kontaktu s intinou (vnitřní vrstva stěny pylu), později se vnoří do cytoplasmy = "a cell within a cell". IASPRR Dvoubuněčný pyl detail buňky generativní v buňce vegetativní IASPRR Tvar generativní buňky často vřetenovitý, buňka je v kontaktu s vegetativním jádrem = "male germ unit" (MGU). Cytoplazma generativní buňky je hustá – méně vakuol a organel. Dvoubuněčný pyl IASPRR TEM pylového zrna pryšce (Euphorbia) (Cresti et al. 1992) dvoubuněčný pyl: u 75% studovaných kvetoucích rostlin dělení generativní buňky na 2 buňky spermatické probíhá v pylové láčce Mikrosporogeneze a mikrogametogeneze u tabáku Schéma vývoje pylu u tabáku Goldberg et al. 1993 Vývoj prašníku Goldberg et al. 1993 Koltunov et al. 1990 otevírání prašníkůotevření květu12 zralá pyl. zrnakoruna zpola otevřená 11 spojení prašných pouzder 8 mizí tapetumkoruna přes kalich3 tetrádypetaly na úrovni sepalů -1 meiozaprašníky pod bliznou -2 intenzivní dělení-6 začátek diferenciaceprimordia tyčinek-7 Stadia vývoje prašníku tabáku Vývoj prašníku tabáku meiosis mikrospory pyl. zrna exotheciumexothecium endotheciumendothecium mezofylmezofyl tapetumtapetum Nicotiana tabacum L. kryostatovkryostatovýý řřezez –– asiasi 40 um40 um exotheciumexothecium endotheciumendothecium zbytky mezofyluzbytky mezofylu aa tapetatapeta konektivkonektiv mikrosporogeneze Nicotiana tabacum L. metafáze I.dělení tetrády počátek tvorby tetrád mikrospora se zbytky kalózy Nicotiana tabacum L. SR1 vakuolizované mikrospory vnější tapetum vnitřní tapetum mezofyl endothecium Pylová zrna Nicotiana tabacum L. DAPI PEG sections Pylová zrna Nicotiana tabacum L. DAPI, UV PEG sections autofluorescence exiny a plastidů fluorescence DNA, autofluorescence exiny apertury vegetativní jádro generativní jádro Nicotiana tabacum L. desikovaný pyl 3 (- 4) apertury SEM, vysušeno metodou „critical poit dry“, pozlaceno Přehled stadií vývoje květu u A.thaliana (Smyth et al. 1990) The Plant Cell, 2, 755-767, 1990 Stadium Charakteristický znak 1 Vznik květního základu 2 Tvorba květního primordia 3 Formace primordií sepalů 4 Sepaly překrývají meristem 5 Vznik primordií petalů a tyčinek 6 Sepaly uzavírají pupen 7 Zakládání nitky u primordií dlouhých tyčinek 8 Diferenciace prašných pouzder 9 Primordia petalů na bázi užší, rychlý růst nahoře 10 Petaly na úrovni krátkých tyčinek 11 Diferenciace bliznových papil 12 Petaly na úrovni dlouhých tyčinek 5. Vznik primordií petalů a tyčinek Vývoj květu u A.thaliana (Smyth et al. 1990) 8. Diferenciace prašných pouzder u dlouhých tyčinek The Plant Cell, 2, 755-767, 1990 Polarita mikrospor a vývoj pylu Arabidopsis kontrola (WT)‫‏‬ mutanti: sidecar pollen scp gemini gem1 Twell et al. 1998 Tetrády pylu Arabidopsis mutant quartet Arabidopsis mutant tes/stud abnormální tvar apertur přirozené tetrády pylu Drosera binata Edlund et al. 2004 Variabilita morfologie pylu Lilium Passiflora Accacia - polyady Torenia Arabidopsis Edlund et al. 2004 Variabilita velikosti pylových zrn 2000Zostera marina až 250Cucurbita 150 až 250Malva 2 - 5Myosotis asi 60anemofilní druhy velikost /μm/Taxon variabilitavariabilita i vi v rráámci jednmci jednéé rostlinyrostliny,, ččastastáá ii polymorfiepolymorfie StanleyStanley etet LinskensLinskens 1974,1974, UnarUnar 19921992 Cucurbita pepo L. AQUASEM mnoho apertur = polysyfonické klíčení pylu Diferenciální barvení pylu Alexander 1969 • 95% ethanol 10 ml • malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% rozt. v 95% eth.) • destilovaná voda 50 ml • glycerol 25 ml • fenol 5g • chloralhydrát 5g • kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodný roztok) • oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodný roztok) • ledová kys. octová 1 - 4 ml Hodnocení viability pylu • barvení – často nadhodnocuje životaschopnost pylu • fluorescenční mikroskopie – aktivita enzymů: esterázy (substrát FDA), peroxidázy (substrát TTC) • klíčivost pylu in vitro • médium pro klíčení pylu in vitro : Brewbaker – Kwack (1964) 100 ml H3BO3 10mg Ca(NO3)2 . 4 H2O 30mg MgSO4 . 7 H2O 20mg KNO3 10mg + 10% sacharóza nebo 10% sacharóza a 1% agar (nanesení média na podložní sklo)