Opylení a oplození Opylení a oplození 1. progamogenetická fáze: – přenos pylu z prašníku na bliznu (opylení s.s.) – vyklíčení pylového zrna na blizně – růst pylové láčky k vajíčku – průnik pylové láčky do zárodečného vaku 2. gamogenetická fáze: syngamie a konfluace oplozeni s.s.) 3. postgamogenetická fáze vajíčko kalózová zátka p.láčka Schéma gynecea s vajíčkem pylové zrno blizna čnělka semeník pestík = soubor plodolistů = gynaeceum Dehiscence (otvírání) prašníků • koordinována s dozráváním pylu • zahrnuje program postupné destrukce buněk • je zakončena prasknutím stomia • kontrola JA fáze dehiscence: – degenerace mezofylu a tapeta – expanze buněk endothecia – fibrosní stěna – degenerace septa mezi prašnými pouzdry – prasknutí stomia – nerovnoměrné sesychání buněk endothecia Zralé pylové zrno při dehiscenci • metabolicky v klidu • silně desikované ( obsah vody jen 15 – 35%) Přenos pylu na bliznu = opylení samosprašnost x cizosprašnost autogamie x allogamie podle způsobu přenosu pylu větrosnubnost x hmyzosnubnost anemofilie entomofylie zoofilie hydrofilie kleistogamie (Oxalis, Viola)zvýšení možnosti autogamie: snížení možnosti autogamie: autoinkompatibilita: heteromorfní - heterostylie dichogamie = protandrie x proterogynie Místa interakcí v pestíku Haworthia Povrch pylového zrna: pylový tmel proteiny ve sporodermě Bliznový exudát Tekutina kanTekutina kanáálulu ččnněělkylky Placentární tekutina Exudát mikropyle Willemsee Hydratovaná pylová zrna lilie Adheze pylu na blizny – první kontakt • přenos pylu – biotické nebo nebiotické přenašeče • adheze pylu podmíněná – morfologií exiny – pylovým tmelem (lipidy a proteiny, glykoproteiny) – typem blizny • vlhká - exudát • suchá - pelikula Typy blizen suchá blizna Arabidopsis barvena FM1-43 200 μm suché blizny s papilamivlhké blizny s exudátem vlhká blizna tabáku indigogenní reakce na beta-glukosidasu Aktivace pylového zrna rehydratace ve vlhku (na blizně, in vitro) Klíčení pylového zrna • hydratace pylu vede k vývoji vysoce polarizované buňky – aktinový cytoskelet se přesunuje k místu klíčení, přesunuje se vegetativní jádro • klíčení: – monosyfonické – polysyfonické Klíčení pylu monosyfonické klíčení pylu polysyfonické klíčení pylu Ontogeneze pylové láčky • aktivace pylového zrna - hydratace • klíčení pylového zrna • invaze pylové láčky do blizny – AcP, esterasy (kutinasy), proteasy, RNAasy • růst pylové láčky • stárnutí pylové láčky Klíčící pylová zrna netýkavky Impatiens glandulifera (Cresti et al. 1992) apertury Opylení u Arabidopsis Edlund et al. 2004 Anilinová modř, UV Fluorescence pylových láček pylu klíčícího na blizně monosyfonické klíčení pylu Zóny pylové láčky 1. čepička 2. pod čepičkou = zóna vysokého obsahu proteinů (arabino-galaktanové proteiny) 3. zóna komplexního endomembránového systému 4. vakuolizovaná část (kalózové zátky) Struktura vrcholu pylové láčky Mascarenhas 1993 123 Růst pylových láček Camacho et Malhó 2003 rychlost až 50um /min je umožněna vysoce polarizovanou fůzí váčků, které transportují složky buněčné stěny k vrcholu hlavní roli v regulaci hraje gradient [Ca 2+] Model pro růst pylové láčky lilie Lord 2000 arabinogalaktanové proteiny stigma-style cysteine-rich adhesin Plné a duté čnělky Arabidopsis Lilium Lord 2001 Detail čnělky tabáku plná čnělka s převodovým pletivem podélný kryostatový řez indigogenní metoda detekce aktivity beta- glukosidasy Tvorba MGU u Arabidopsis Lalanne et Twell :PP 2002 Stárnutí pylové láčky u láček pěstovaných in vitro nebo při inkompatibilitě • zastavení růstu • utvoření kalózové čepičky na vrcholu • vakuolizace vrcholové části • degenerace celého obsahu Chemoregulace růstu pylových láček Torenia Torenia Arabidopsis Higashiyama et Hamamura 2007 Diferenciální barvení pylu Alexander 1969 96% ethanol 10 ml malachitová zeleň 10 mg destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml fenol 5 g chloralhydrát 5 g kyselý fuchsin 50 mg oranž G 5 mg ledová kys. octová 1 – 4 ml abortovaná pylová zrna jsou zbarvena zeleně, dobře vyvinutá (neabortovaná) červeně Hodnocení viability pylu • barvení – často nadhodnocuje životaschopnost pylu • fluorescenční mikroskopie – aktivita enzymů: esterázy (substrát FDA), peroxidázy (substrát TTC) • klíčivost pylu in vitro médium pro klíčení pylu in vitro: Brewbaker – Kwack (1964) 100 ml H3BO3 10mg Ca(NO3)2 . 4 H2O 30mg MgSO4 . 7 H2O 20mg KNO3 10mg + 10% sacharóza nebo 10% sacharóza a 1% agar (nanesení média na podložní sklo) Bariéry oplození • vnější – nepřiměřená teplota a vlhkost – nedostatečná výživa – působení fyzikálních nebo chemických vlivů • vnitřní prezygotické – inkompatibilita – inkongruita (nedostatek informace a koordinace) – samčí nebo samičí sterilita postzygotické - malformace vývoje endospermu - bariéry klíčení embrya Inkompatibilita (neslučitelnost) • neschopnost rostlin tvořit semena, přestože mají funkční gamety • před 200 lety - Kölreuter - Verbascum - po samoopylení netvořila semena, zatímco po cizosprášení ano • Stout (1917) - studium fertility Cichorium intybus Typy inkompatibility • vnitrodruhová (autoinkompatibilita) • heteromorfní (distylie, tristylie) • homomorfní – sporofytického typu – gametofytického typu • mezidruhová • mezirodová Funkce inkompatibility • zabránění samoopylení – podporuje cirkulaci genů v populaci • zabránění mezidruhovému nebo vzdálenějšímu (mezirodovému) křížení (zábrana „gene flow“) - podporuje stabilitu druhu Nettancourt et Devreux 1977 Inkompatibilita sporofytického typu • je daná genotypem rostliny, která produkuje pyl (sporofytem). Bez ohledu na genotyp si pyl ponechává fenotypovou reakci dominantní alely • projevuje se již na povrchu blizny (proteiny z tapeta) • suché blizny a 3 buněčný pyl Inkompatibilita gametofytického typu • je určována genotypem samotného pylového zrna (gametofytu) • projevuje se až při prorůstání pylových láček přes pletiva čnělky a zárodečného vaku - zastavování růstu pyl. láček • vlhké blizny – u čeledí Viciaceae, Solanaceae Inkompatibilita gametofytického typu sporofytického typu tyčinka S1/S2 tyčinka S1/S2 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pyl pyl S1 S2 S1 S2 Synergidy a filiformní aparát Petunia Torenia Zea Gossypium Synergidy pylová láčka vstupuje do z.v. přes receptivní synergidu známky receptivity synergidy: 1. reorganizace cytoskeletu 2. Ca2+ akumulace 3. degenerace organel a plazmatické membrány 1898: This is the short description of double fertilization from a 24 August 1898 meeting presentation given in Russia by Sergius Nawaschin reported in German in Botanisches Zentralblatt. Průběh syngamie • apozice plazmatické membrány vaječné a spermatické buňky • spermatické jádro s částí cytoplasmy se dostává do vaječné buňky • fůze jader • fůze jadérek Syngamie Na mikropylárním pólu zárodečného vaku (vpravo) je malé jádro spermatické buňky a větší jádro vaječné buňky, po fůzi vznikne zygota IASPRR Chalazální konec zárodečného vaku druhé oplození = konfluace splývající polární jádra (méně hustá) a tmavší samčí jádro výsledkem této fůze (triple fusion) bude 5N endosperm (1N + 1N + 3N). IASPRR Konfluace - Triple fusion jádro vlevo je 3N (dříve chalazální) polární jádro, uprostřed je samčí spermatické jádro, vpravo 1N (dříve mikropylární) polární jádro IASPRR