Molekulární biotechnologie č.10a •Využití poznatků molekulární biotechnologie. Molekulární diagnostika. Využití molekulární biotechnologie – v mnoha oblastech •Molekulární diagnostika •Bioremediace a využití biomasy •Využití škrobu a sacharidů, utilizace celulózy •Mikrobiální insekticidy •Baktérie stimulující růst rostlin •Vakcíny a terapeutické proteiny. •Příprava a využití transgenních rostlin. Nové potraviny. •Příprava a využití transgenních zvířat. •Genová terapie lidských somatických buněk. • • Molekulární diagnostika •Diagnostikuje specifické molekuly •virů, baktérií, hub, parazitů u lidí, zvířat, rostlin, •v klinickém materiálu, ve vodě, v odpadech, v potravinách apod. • Srovnání různých diagnostických metod (Glick a spol. 2003) Molekulární diagnostika je vysoce •Specifická tj. pozitivní pouze pro hledanou molekulu (buňku) v nadbytku ostatních molekul •Citlivá (sensitivní) tj. umožňuje identifikaci malého množství molekul (buněk), nejlépe jednu •Jednoduchá a levná z důvodu praktického využití Využívá zejména •vysoké afinity protilátek k antigenům (imunodiagnostické metody) •DNA/DNA hybridizace komplementárních sekvencí DNA a DNA amplifikace (metody analýzy DNA) • Imunodiagnostická metoda •ELISA – enzyme linked imunosorbent assay - pro detekci specifického antigenu •Cílová molekula (bakteriální buňka s antigeny - povrchové molekuly vyvolávající v organismu tvorbu protilátek) je imobilizována na mikrotitrační destičce •Na antigen se váže primární protilátka (přítomná např. ve vzorku krevního séra) •Na primární protilátku se váže sekundární protilátka s kovalentně navázaným (konjugovaným) enzymem •Enzym reaguje se substrátem za vzniku zabarvení (positivní reakce) Obr.8.1 Obecný protokol ELISA (Glick a spol. 2003) •. Protilátka – glykoprotein (imunoglobulin) •Je produkovaná jako odpověď organismu na stimulaci imonogenem •Vyznačuje se schopností reagovat in vitro a in vivo specificky a selektivně s antigenními determinanty imunogenu, který vyvolal její produkci •V přírodě se protilátky tvoří v krevních buňkách savců jako reakce na infekce – protilátky polyklonální Antigen s 7 různými antigenními determinantami vyvolá tvorbu polyklonální protilátky (Glick a spol. 2003) Dva druhy protilátek •Polyklonální •Monoklonální – soubor molekul specifických pro jeden epitop •jsou produkovány hybridomy Selekce hybridomů (Glick a spol. 2003) (spleen – slezina) Produkce monoklonálních protilátek hybridomy (Glick a spol. 2003) Monoklonální protilátky jsou používány v diagnostice (Glick a spol. 2003) •. Protilátky •Mohou být komerčně syntetizovány v E. coli •V nich jsou klonovány geny kódující jednotlivé řetězce imunoglobulinů DNA diagnostické systémy •Jsou založeny na hybridizacích komplementárních řetězců nukleových kyselin •Jedná se o hybridizaci sond (značených jednořetězcových molekul) •O hybridisaci specifických oligonukleotidů a amplifikaci molekul DNA (s následnou analýzou) • Detekce genu zodpovědného za srpkovou anémii se skládá z těchto kroků •Amplifikaci cílové sekvence DNA •její štěpení restriktázou •separace fragmentů pomocí gelové elektroforézy na agaróze •Analýza amplikonů Detekce srpkové anémie pomocí PCR a analýzy amplikonu Pomocí DNA sond •S využitím ligace •Lze detekovat jednobodové mutace •Metoda PCR/OLA (oligonucleotide ligation assay) Detekce jednobodové mutace v genu (Glick a spol. 2003) Při detekci cílových molekul DNA •Se využívá afinitních molekul •Biotin (avidin) a streptavidin •Na streptavidin lze navázat další biottiny s přikonjugovaným enzymem •Detekuje se činnost enzymu • Detekce biotinem značené cílové DNA (Glick a spol. 2003) Southern bloty a DNA/DNA hybridisace •Nacházejí uplatnění v kriminalistice Využití Southern blotu a DNA/DNA hybridizace v kriminalistice (Glick a spol. 2003) DNA analýza se využívá v šlechtitelství •Při rozlišení kultivarů • •PřRF 16.11.2010