Molekulární biotechnologie Č.3 Základní kroky při přenosu genů – klonovací vektory (Glick a spol.2006) •. DNA (cílová, cizorodá, klonovaná) •Je izolována z donorového organismu a •enzymaticky naštěpena na fragmenty. •Fragmenty jsou včleněny do jiné molekuly DNA (klonovací vektor) •za vzniku rekombinantní DNA (konstrukt vektor-insert) Jako klonovací vektory •Se využívají plasmidy - autonomní samoreplikující se genetické elementy •Upravené tak, aby měly žádoucí vlastnosti • Vlastnosti klonovacího vektoru vysoké kvality •Malá velikost (účinnost přenosu do E.coli se snižuje u plasmidů nad 15 kb) •Přítomnost 1 cílového místa pro restrikční nukleázu (pro vnesení cizorodé DNA) •Vhodný selekční marker pro identifikaci buněk, které nesou plasmid Klonovací vektor pBR322 •První klonovací vektor •Funkční v E. coli •40 kopií/buňku •4361 bp •nekonjugativní • • • Plasmid pBR322 – základní genetické elementy •Místo ori (počátek replikace) funkční v E. coli •Gen pro resistenci k ampicilinu s jedním cílovým místem pro PstI •Gen pro resistenci k tetracyklinu s jedním cílovým místem pro HindIII, BamHI a SalI •Jedno cílové místo pro EcoRI mimo kódující oblasti • Genetická a fyzikální mapa plasmidu pBR322 (Glick a spol. 2006) Použití plasmidu pBR322 jako klonovacího vektoru – 2 kroky •Vložení cizorodého fragmentu DNA do plasmidu (příprava rekombinantní DNA) •Transformace a selekce transformantů nesoucích rekombinantní DNA Pro vložení cizorodého fragmentu DNA •jsou k dispozici cílová místa pro restriktázy lokalizovaná v genech pro rezistenci na antibiotika (ampicilin, tetracyklin) • • Vložení cizorodého fragmentu DNA do plasmidu pBR322 •Plasmidová DNA je štěpena restriktázou, která má jediné cílové místo v některém genu pro resistenci k antibiotiku •Vzniknou lineární molekuly plasmidové DNA s přečnívajícími konci se sekvencemi nukleotidů podle použitého enzymu •Tyto linearizované molekuly jsou smíchány s cílovou DNA, která byla naštěpena stejnou restriktázou •Směs je inkubována s DNA ligázou (T4 DNA ligáza) za přítomnosti ATP) •Klonuje se do PstI místa v genu pro rezistenci k ampicilinu (vkládají se fragmenty DNA získané po naštěpení DNA enzymem PstI) •Klonuje se do BamHI, HindIII nebo SalI místa v genu pro rezistenci na tetracyklin (vkládají se fragmenty získané po naštěpení DNA enzymem BamHI, HindIII nebo SalI) Působením T4 ligázy •Vznikají rekombinantní DNA molekuly (plasmid-insert) •Dochází k recirkularizaci plasmidu • • Recirkularizaci linearizovaného plasmidu se zamezí •odstraněním fosfátových skupin alkalickou fosfatázou • Ostranění fosfátových skupin alkalickou fosfatázou (Glick a spol. 2006) •. Vznik rekombinantní DNA se zlomy (nicky) •Dvě fosfodiesterové vazby mezi plasmidovou DNA a klonovaným DNA fragmentem udrží obě molekuly pohromadě • •Zlomyv rekombinantní DNA jsou po transformaci opraveny reparačním systémem bakteriální buňky • • Vpravení klonované DNA do buněk E. coli •Se nazývá transformace •Chemická transformace je málo účinná (transformováno méně než 0.01% buněk) •Většina buněk plasmid nezíská •Některé buňky získají recirkularizovaný plasmid •Některé buňky získají jinou DNA než plasmidovou •Pouze část buněk obsahuje správný DNA konstrukt • K rozlišení buněk, které získaly po transformaci cizorodou DNA slouží •Selekční markery •Jsou to geny pro rezistenci k antibiotikům •Umožňují rozlišit buňky (transformanty), které nesou nerekombinantní a rekombinantní DNA Antibiotika používaná pro selekci (Glick a spol. 2006) Transformace se provádí do buněk E.coli •E.coli citlivých na tetracyklin a ampicilin •(rozmezí hostitele záleží na místě ori na plasmidu) Selekce transformantů nesoucích rekombinantní pBR322 DNA •se provádí podle toho, do kterého cílového místa pro restriktázu byl klonován cizorodý fragment DNA • Selekce transformantů s rekombinantní DNA se provádí ve dvou krocích •Klónujeme-li do BamHI místa (v genu pro resistenci na tetracyklin) porušíme gen pro rezistenci na tetracyklin. •Transformanty se vysévají nejprve na misky s ampicilinem. Tam narostou všechny ampicilin resistentní transformanty (kolonie), co získaly plasmid. •V druhém kroku se rozlišuje mezi transformanty, co získaly rekombinantní a nerekombinantní plasmid výsevem na misky s tetracyklinem •Rekombinantní plasmid s cizorodou DNA nesou transformanty citlivé na tetracyklin. • Selekce transformantů s rekombinantní DNA se provádí ve dvou krocích •Klonujeme-li do restrikčních míst v genu pro resistenci na ampicilin, dojde k porušení tohoto genu •Transformanty jsou testovány výsevem na misku s tetracyklinem. Tam narostou (vytvoří kolonie) buňky, co získaly plasmid •Tyto jsou v dalším kroku testovány výsevem na misky s ampicilinem •Rekombinantní plasmid s cizorodou DNA nesou transformanty sensitivní na ampicilin (a reuistentní) na tetracyklin. •K analýze transformantů lze použít tzv. bakteriologické razítko • Význam EcoRI místa v DNA pBR322 •Pro linearizaci a stanovení velikosti •nerekombinantního plasmidu (bez cizorodého fragmentu DNA) a •rekominantního plasmidu. •Velikost plasmidu se stanoví pomocí agarózové gelové elektroforézy (spolu se standardy o známé délce) Nevýhody plasmidu pBR322 jako klonovacího vektoru •Malý počet klonovacích míst •Časově náročnější selekce buněk nesoucích rekombinantní plasmid (2 dny) • Plasmidový vektor pUC19 •Připraven genetickými manipulacemi •Funkční v E. coli •1000 kopií na buňku •2686 bp •nekonjugativní Plasmid pUC19 – základní genetické elementy •Místo ori (počátek replikace, z plasmidu pBR322) •Gen pro resistenci k ampicilinu (selekční marker) •Mnohočetné klonovací místo (polylinker) s cílovými místy pro 20 restriktáz •Část laktózového operonu z E. coli (regulační oblast s lacI genem a lacZ´ genem) •lacI gen kóduje represor, který reguluje expresi laktózového operonu vazbou na P •lacZ´ gen, který kóduje N terminální část betagalaktosidázy •Mezi lacI a lacZ´ je umístěno mnohočetné klonovací místo (polylinker) tak, že není narušen čtecí rámec • • • • Klonovací vektor pUC19 – genetická mapa (Glick a spol. 2006) Mnohočetné klonovací místo (polylinker) plasmidu pUC19 (Glick a spol. 2006) •. Jak funguje pUC19 jako klonovací vektor •Plasmidová DNA je štěpena některou restriktázou, která má jediné cílové místo v mnohočetném klonovacím místě •Vzniknou lineární molekuly s přečnívajícími konci podle použitého enzymu •Linearizované molekuly jsou (po defosforylaci alkalickou fosfatázou) smíchány s fragmentem cílové DNA, která byla naštěpena stejnou restriktázou •Směs je inkubována s T4 ligázou (v přítomnosti ATP) a transformována do buněk E. coli , vhodných pro selekci transformantů nesoucích rekombinantní plasmid pUC19 Transformace se provádí do •buněk E. coli , které nesou deleci (Δ M15) v genu pro beta-galaktosidazu a které jsou sensitivní na ampicilin •V buňkách se syntetizuje C terminální část beta galaktosidázy, která není funkční •Hostitelské buňky neutilizují laktózu a ani nehydrolyzují substrát X-gal •Na médiu s laktózou rostou béžově •Na médiu s X gal tvoří bílé kolonie • Alfa komplementace •Získají-li buňky E. coli Δ M15 chybějící část genu pro beta galaktozidázu (tj. gen lacZ´), v buňkách se syntetizuje jak C terminální tak N terminální část proteinu •obě části proteinu v cytoplasmě komplementují za vzniku funkční beta galaktosidázy (a buňky utilizují laktózu a hydrolyzují X-gal) •Na miskách s Mac Conkey agarem rostou červeně, na miskách s Xgal rostou modře •Chybějící část genu pro beta galaktosidázu mohou získat spolu s nerekombinantním plasmidem pUC19 • Selekce transformantů se provádí •Se provádí v jednom kroku •Transformanty jsou vysety na LB misky s ampicilinem a X-gal substrátem (a IPTG, který inaktivuje represor) •Vyrostou všechny kolonie (transformanti), co získaly plasmid •Vysévat lze i na Mc Conkey agar s ampicilinem a IPTG • • Selekce transformantů nesoucích rekombinantní a nerekombinantní DNA pUC19 •Využívá toho, že díky inserci cizorodé DNA se poruší gen lacZ´ •Kolonie transformantů se odlišují zabarvením •modře rostou kolonie, co získaly nerekombinantní plasmid, protože se v buňkách tvoří funkční beta galaktosidáza, která stěpí X-gal • bíle rostou kolonie, co získaly rekombinantní plasmid a v jejichž buňkách se netvoří funkční beta galaktozidáza a nedochází k štěpení X-gal • tzv. Modro-bílá selekce •Na Mac Conkeyho agaru je selekce červeno-béžová • • Isopropylthiogalaktosid - IPTG •Se váže na represor (produkt genu lacI laktózového operonu) •Díky této vazbě dojde k uvolnění represoru z operátoru •To umožní navázání RNA polymerázy na promotor • a transkripci (a následnou translaci) genu lacZ´ Dvě funkce klonovacích míst na vektoru •Inserce cizorodé DNA •Excise cizorodé DNA •K excisi se používá stejná restriktáza, která byla použita pro inserci •PřF 5.10.2010 •7.10. FCh