Molekulární biotechnologie č.7 Zvyšování účinnosti translace •Zvýšení produkce rekombinatního proteinu. Ovlivňování účinnosti translace •Množství klonovaného proteinu závisí rovněž na účinnosti translace U prokaryontních buněk •Nedochází k translaci z různých mRNA se stejnou účinností •Hladiny v syntéze proteinů jsou až stonásobné •Rozdíly v účinnosti translace (spolu s regulací transkripce) umožňují buňce mít stovky a tisíce molekul nějakého proteinu a jen několik molekul jiného proteinu Molekulární základ rozdílné translace tkví •V přítomnosti iniciačního translačního signálu na mRNA, •Který se nazývá ribosomové vazebné místo •Je to sekvence 6-8 nukleotidů na mRNA, která se páruje s komplementární sekvencí RNA malé ribosomové subjednotky •Tato sekvence se nazývá Shineova-Dalgarnova Sekvence Shineova – Dalgarnova - definice •Sekvence přepisující se u baktérií z negativního DNA-řetězce do 5´konce mRNA jako 5´AGGA 3´, •Kterou se pak mRNA váže k sekvenci 3´UCCU 5´, nacházející se na 3´konci 16S rRNA ribosomové subjednotky 30S, a umožňuje tak v bakteriálních buňkách vazbu mRNA k ribosomu Účinnost translace •Závisí na síle vazby mRNA na ribosomovou RNA •Čím je větší síla vazby, tím je větší iniciace translace Expresní vektory E. coli byly optimalizovány •aby bylo zajištěno, že mRNA klonovaného genu má silné ribosomové vazební místo K zabezpečení správné funkce rbs musí být •sekvence vázající se na ribosom lokalizována v přesné vzdálenosti od translačního startovacího kodonu klonovaného genu •DNA nesmí obsahovat sekvenci, která by po transkripci do mRNA tvořila vlásenky a tím bránila interakci mRNA s ribosomem – viz Obr. Příklad vlásenkové struktury Vlásenková struktura mRNA Expresní vektor pKK233-2 s transkripčními a translačními signály •Pro vysokou expresi klonovaného genu Vektor obsahuje •Gen pro ampicilin rezistenci (selekční marker) •tac promotor •rbs genu lac Z •3 klonovací místa (NcoI, PstI, HindIII) •2 sekvence pro terminaci transkripce (T1, T2) Expresní vektor obsahující silné rbs Snížení produkce klonovaného proteinu může nastat •Z důvodu malého množství molekul tRNA v buňce, když klonovaný gen obsahuje kodony málo využívané hostitelskou buňkou (genetický kód je degenerovaný a pro jednotlivé AK můžou být různé tRNA) •Potom lze chemicky syntetizovat novou verzi genu s kodony, které jsou hostitelskou buňkou nejčastěji používány (tzv. optimalizace kodonu) •nebo geneticky manipulovat buňky E. coli tak, aby syntetizovaly více vzácných tRNA Schéma znázorňující buňky E. coli geneticky manipulované tak, aby produkovaly dostatečné množství vzácných tRNA • Další možností •Je integrace cizorodé DNA do hostitelského genomu •Je-li klonovaná DNA součástí chromosomu hostitelské buňky, je relativně stabilní Integrace cizorodé DNA do hostitelského genomu •Se využívá, když jsou problémy se stabilitou plasmidu •Když je třeba zajistit, aby se klonovaná DNA v organismu udržela bez selekčního tlaku (v průmyslu je přidávání antibiotika do média finančně náročné) • •V buňkách se může udržet po několik generací bez selekčního tlaku Integrační vektory •Umožňují včlenit klonovaný gen do chromosomu hostitelské buňky •K inserci nesmí dojít uvnitř genu, který je pro život buňky esenciální •Gen bývá obvykle vložen do chromosomu buňky tak, aby byl pod kontrolou regulovatelného promotoru • Pro integraci se využívá •Homologní rekombinace •Pro ni je nezbytná sekvenční homologie •mezi integrující DNA a chromosomem Pro integraci cizorodého genu do chromosomu buňky •Byly zkonstruovány integrační vektory Konstrukce integračního vektoru se skládá z těchto kroků •1. Identifikace vhodného místa na chromosomu buňky pro integraci tj. identifikaci úseku DNA, které může být porušeno bez ovlivnění normálních funkcí buňky •2. Izolace tohoto chromosomálního integračního místa a jeho klonování v integračním vektoru •3. Vligování klonovaného genu s regulovatelným promotorem do chromosomálního integračního místa •4. Přenos integračního vektoru s klonovaným genem do hostitelských buněk. Vektor je konstruován tak, že se v hostitelských buňkách nemůže replikovat •5. Selekce a pomnožení hostitelských buněk, které exprimují klonovaný gen. Klonovaný gen se může exprimovat jen tehdy, když byl integrován do chromosomu hostitelské buňky. K integraci může dojít •V důsledku dvojitého crossing-overu – integruje se část integračního vektoru •Jednoduchého c-o – integruje se celý integrační vektor Integrace genu do chromosomu jednoduchým a dvojitým c-o • Ovlivňování místa sekrece cizorodého proteinu v buňce •Stabilita klonovaného proteinu často závisí na jeho lokalizaci v buňce •Např. rekombinantní proinzulin je 10x stabilnější, je-li sekretován do periplasmy •Proteiny sekretované do periplasmy nebo růstového média se snadněji purifikují Signální peptid •Na N-terminálním konci proteinu •Ovlivňuje průchod proteinu bakteriální membránou •Změnou signálního peptidu lze ovlivnit lokalizaci proteinu Ovlivňování sekrece proteinu v buňce Genetický konstrukt pro produkci fúzního proteinu se signálním a markerovým peptidem • Úprava sekrece interleukinu-2 Schématické znázornění metabolické zátěže při nadprodukci proteinu buňkou •. Vliv počtu kopií plasmidu na růstovou rychlost buňky Pro produkci proteinů lze použít jiné mikroorganismy než E. coli • Velké množství proteinů sekretují do růstového média vláknité houby (rod Aspergillus) •. PřF 26.10.2010