METAPLASIE (-TRANSDIFERENCIACE?!) metaplasie - přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednoho typu tkáně v progenitor tkáně jiné transdiferenciace -přeměna buňky jednoho typu na buňku typu jiného bez průchodu buněčným cyklem transdeterminace - metaplasie v průběhu embryogeneze Rawlins & Hogan (2006) Development 133, 2455-2465 Potenciální možnosti: 1) Přímá přeměna fenotypu buňky jednoho typu v buňku typu jiného - s proliferací (metaplasie) - bez proliferace (pravá transdiferenciace) 2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace do jiné diferenciační řady (rediferenciace a následně diferenciace). Za pozorované jevy zřejmě ale odpovídají zbytkové populace progenitorů. - s proliferací - bez proliferace (silně nepravděpodobné) Přístupy: Vnějšími faktory b) Exogenní expresí vhodných genů c) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky (sem patří i terapeutické klonování) d) Kombinací výše zmíněných postupů -změny v metylaci DNA / metylačním paternu (CpG a CpA oblasti) tyto modifikace jsou relativně obtížně změnitelné -změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů - telomery / telomerázy -změny v PcG proteinech => transkripce jiných genů = jiný fenotyp A. vnějšími faktory -máláa často sporná účinnost - závislé na buněčném typu, často jen u SCs a TA buněk - pokud je to možné, tak se většinou jedná o malou změnu / krok (!není úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!) - uplatnitelnost in vitro spíše s některou z dalších metod a zejména pro zachování získaného fenotypu re- / transdeterminovaných buněk Příklady: - exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty - epitel hltanu -> střevní epitel (po poškození žaludečními kyselinami, tzv. Barrettova metaplasie) - progenitory glií ??? - pigmentové buňky oka (iris) -> buňky rohovky (u čolka) -některé kultivační experimenty ukazují, že různé progentory / SCs mohou nabývat fenotypu jiné diferenciační řady, např SCs / TA epidermis x nervová tkáň - B-lymfocyty mohou tvořit makrofágy Pleopotence* x reprogramování (změna v determinaci) multipotentní terminálne diferencované buňky B. exogénni exprese vhodných genů - výrazně účinějši než působeni vnějšich faktorů - „vhodné" geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny a transkripčni faktory - epigenetická paměť buněk (zejména metylace DNA), ale nedovoluje úplnou změnu, je potřeba několikateré děleni buněk, pokud je daná změna vůbec možná, vlastni fenotyp se ale měni velice rychle Přiklady: - nadbytečná exprese Ras a c-Myc indukuje částečnou rediferenciaci a transformaci - exprese Pdxl (marker p-buněk pankreatu) navozuje částečný fenotyp p-buněk u hepatocytu a střevnich epiteliálnich buněk - exogeni exprese c-Myc, Klf4, Oct4 a Sox2 navozuje fenotyp ESCs => iPSCs u embryonálních fibroblastů (myš), ale i dalši buňky - transdeterminace Pax a Hox geny (např. Pax-6 a oči) iPS buňky - indukované pluripotentní buňky (Hochedlinger & Plath 2009) Preimplantation embryo Primitive endoderm +Gata4/6 ICM/ES - - - ■* (IPS) +Cdx2 Trophectoderm +Oct4 +Sox2 +KIÍ4 / C+cMyc) / Progenitors Blood progenitors -Pax5 +Myod Fibroblasts — —►Muscle Mature cells +Cabpa B cells — — ► Macrophages Acinar cell — — ► ß cell +Pdx1, Ngn3, Mafa Key ^^^^^^ Normal differentiation — — ^ Transcription factor-induced reprogramming +/- Factor Ectopic expression/deletion of transcription factor Somatic cells • Somatic markers silenced • Activation of SSEA1 Intermediate cells (transient population) Silencing of retroviral transgenes Activation of pluripotency genes Activation of telomerase Reactivation of silent X chromosome in female cells Teratomas and germ line chimeras iPS cells Knockdown of lineage genes Inhibition of DNA methylation Partially reprogrammed cells (stable cell lines) ■ Viral transgenes on ■ Proliferation genes activated ■ Pluripotency genes silent ■ Aberrant expression of lineage genes ■ Teratomas, but no adult chimeras Endogenní transkripční faktory daný/původní fenotyp buňky Exogenní(ektopické) transkripční faktory požadovaný fenotyp buňky i 11 Endogenně regulovaný výsledný fenotyp buňky Exogenně dodané transkripční faktory nebývají dostatečně pevně fixovány v genomu - požkození genomu (vlastní vnesení exogenní informace) - destabilizace fenotypu, částečné reprogramování, reverze fenotypu, nežádoucí transformace C. Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky závislost na momentálním stavu buňky velice účinné, ale přenos jádra málo úspěšný u savců fůze buněk je ale relativně běžná buněčná fůze heterokaryon spojení cytoplasmy a jader dvou buněk za vzniku buňky jediné produkt fůze buněk jasně odlišitelnými dvěma nebo i více jádry hybridní buňka - vznikne když heterokaryon projde mitózou za vzniku buňky s jedním jádrem ale s více jak 2n DNA (nemusí obsahovat kompletní jadernou DNA původních buněk) Úplné reprogramování terminálne diferencované buňky cytoplasmou oocytu u žab (ale i savci). Heterokaryon Purkiňova neuronu v mozečku a GFP+-BMSSC Myš klonovaná z jádra čichového nervu BMSSCs exprimující ß-galaktosidasu pod kontrolou svalově specifického promotoru Regenerace samicích Fah -/-letálních jater (FAH - fumarylaceto-acetate hydroláza) transplantací samčích HSCs Detekce Y chromozomu v játrech po transplantaci (dole) a FAH aktivity vpravo nahoře. Reprogramování jádra, metylace DNA a chyby v embryogenezi 1 jn 100 1 *4 ti » JO Demetylace otcovského, ^^^^^^Ha reprogra-movaného (jaderný přenos) genomu Blastocyst type Oct4 m RNA 22 (%) ICM restricted ICM and TE not detected Cumulus cell clone 53d 18 [34,0]" 29 [54.7)" 6 [11.3]" IVF 30 23 [76J)h 4 (13.3)b 3 [101" ICSI 80 60 [75.0)1, 9(lL3)b 11 [13,S]B't In vi%ro fertilized 75 70 [93.3]c 3 (4.0 t 2 [2.7]'1,<: Analýza exprese Oct4 mRNA u klonovaných a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace). OFP^bljsítoťysl Účinek reprogramování jádra diferencované buňky na expresi Oct4-GFP a schopnost růstu ICM. Vývoj klonů a IVF/ICSI embryí exprimujících GFP in vitro. H ■1 n % ES ■ K ES blastocysts 15 17 18 oviBfpui-Úis 4 31 13 48 11 ól GFP t oMgmwlii strong 2 50 -0 0 * 2 SO - 1 61 -4 )1 ■ 1 3 - 1 9 -(i 0 -10 91 3 chi 3quare