Tkáňové kultury E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Tkáňové kultury (= TK, Tissue culture - TC) -růst živočišných buněk a tkání in vitro 1885 - ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku 1940 - EARLE, první kontinuálně kultivovaná linie, buňky myší pojivové ^^Htkáně, jejím subklonem je dnešní linie L929 Provozování tkáňových kultur spočívá v zajištění optimálních podmínek pro růst a přežívání kultivovaných buněk / tkání! (Pro jednoduchost se dále budou uvažovat jen buňky, problematika tkání a orgánů bude doplněna na závěr.) FYZIKÁLNÍ, CHEMICKÉ a BIOLOGICKÉ faktory, které je třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek. TEPLOTA Buňky se kultivují při optimální teplotě pro organismus, z kterého byly izolovány. Pro buněčné linie odvozené od člověka a běžných laboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37oC. Pro buněčné linie odvozené od poikilotermních živočichů (ryby, hmyz, háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25oC. Na CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejich komponenty) v kterých buňky rostou a plyny, které tato média obklopují případně jsou v nich rozpuštěny. Složení médií Veškeré komponenty použité pro přípravu médií musí být vysoké kvality, s minimem nežádoucích příměsí (minimální chemická čistota p.a. - pro analýzu) Základem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojem nezbytných iontů, a hrají významnou úlohu v zajištění vhodného pH (optimium většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280320 mOsmol/L). Nejzákladnější ionty obsažené v médiích jsou: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43-, HCO3-. Osmotický tlak je roven koncentracím rozpuštěných iontů/molekul 1 M NaCl = 1 Osm/L Na+ + 1 Osm/L Cl- = 2 Osm/L 1 M CaCl2 = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cl- = 3 Osm/L 1 M glukosy = 1 Osm/L Esenciální látky pro růst buněk Média musí také obsahovat sacharidy (většinou glukózu, jako zdroj energie), aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky. Většina zejména savčích buněk vyžaduje Insulin (příjem glukózy) Transferin (příjem železa) Selen (nezbytný pro funkci oxidačně-redukčních enzymů) -takétzv. minimálnípřídavek do médií Další doplňky Lipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteiny extracelulární matrix, proteiny séra, nukleosidy,... Mnohé z těchto látek jsou suplovány přídavkem séra (5 -10 - 20%), v některých případech i jinými zdroji málo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňky jsou ochranné látky jako 2-p-merkaptoetanol (snižuje oxidativní stres a může sloužit i jako zdroj síry) a antibiotika (ochrana proti mikroorganismům případně selekční agens) Základní média v tkáňových kulturách Základem jsou tzv. Earliho soli: chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, síran horečnatý, dihydrogenfosfát sodný BME with EBSS - základní (basal) médium s Earliho solemi Alfa MEM - alfa modifikované Eaglovo médium DMEM RPMI 1640 IMDM Hamovo F12 Dulbekovo MEM, běžné pro adherentní buněčné linie zejména buňky hematopoetického původu Iscovovo modifikované Dulbeccovo médium, vhodné pro rychle rostoucí buňky - médium bohaté živinami, často v kombinaci 1:1 s DMEM jako základ pro kultury bez séra DMEM - high glucose -......* 4*14 g Gtjioln* 7S 00 0.4 ajTOjI-LJautomln* ZZ 1 $00 L--i glnln* ■: (hi-: i Id* i 11 $4 D.lll L-Clrfnn 2 HQ * 1* 0* o.-:o i L-HUIdln* liydrcchlcrldc-Hiij Z1D 4i o.i L-lmlnuDlnn I31 IDE o.oo: L-Lnunlnn iii I0£ o.oo: L-Lydn« 1 ■.- ■ 11 ■: (Ilk i hit i** 14« 0.7BB L-lfctilnnlnn 14B so o.-:o i L-Rinnjlnlnnlnn 10* 00 0.4 L-Bnrlnn ios 4i 0.4 L-Ttirnnnlna MB OS 0.7BB L-Tr,T't'plun ZD4 10 0.0704 \.-T,tq :hit i* i 7; 0. J00 L-Yalln« i it 04 0.00 i vitamin g Cliolln* ohlorld* 140 4 o.OiOO ELCalolum p-hntaliGhita 477 4 0.00000 Foil* Aold 44I 4 0.00007 ■InnlnnmldB IZZ 4 O.OOiO FyTldoiln* lijTdroohlorld* ZD4 4 ioo Hbnlnirin 070 0.4 0.00 100 UMamln* 11 :.d T'l- ■:< 111 ■:■ rl-J ■> 007 4 D.D11B Mnntital ISO 7.1 D.D4 Calcium eWorld* (Caai-iHiui 147 ZI4 i.O milt Hii-i*.r.h:j.j^h;o. 404 0. 1 0.000140 r.Vidii* dum Oulta* .Md OOf HiOQ 141 iOO D.lll Fv.tJ r.rjum Oilorldn (HQ) 7i 40 D s.oo Oodlum Hojrbona* ■;HaHCOS> $4 0700 44.0s Bndlum Ctilnrldn (Had) SO 0400 1 10. J4 Oodlum Fliocphata monobaNo (HaHIFQ4-ZHID] 114 141 io Oli»rQ.mPon*nfc EMauo* » ■ D» tro ») 100 4S00 is 0.0000 Sérum -nejčastěji bovmm fetální*, ale i jiné zdroje - lidské, koňské, kozí, myší,... - embryonálí (fetální), novorozenecká, dospělá *fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek) -ruzné stupne kvality - testy na přítomnost endotoxinů - testy na snášenlivost konkrétním typem buněk testy na přítomnost virů -ruznézeme puvodu (USA, Austrálie,...) -ruznésarze (lot number) pH Při přípravě médií je pH nastaveno/doladěno HCl (1M) a NaOH (1M). pH v kultuře se mění v důsledku metabolismu buněk, zejména produkcí laktátu a CO2 V průběhu kultivace je udržováno: 1) Přítomnými ionty, zejména fosfátovými (z fosforečnanů) 2) Proteiny s pufračními schopnostmi 3) Systémem H2CO3 / CO2 4) Alternativně silně pufruiícimi látkami jako je HEPES, BES, TES K orientační detekci pH média v kultuře slouží fenolová červeň přidávaná do médií. < 6 7 < 8 pH Pufrační systém H2C03 / C02 (NaHC03) C02 + H20 = H2C03 = H+ + HC03- http://www2.biomed.cas.cz/d331/vade/ph.html Kultivace : otevřena - s výmenou plynu (zejména prísun CO2 z vnejsku) uzavřená - bez výmeny plynU (používá se ~ y množství NaHCO3) -Pri otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s navýšeným obsahem C02, standardně 5% CO2 (regulovaný přísun ze zásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častěji spontánním odparem ze zásobníku. V některých speciálních případech je vhodné použít polotekutá až pevná média Takové médium se připraví přídavkem: - Agaru (je třeba dávat pozor na přehřátí složek média během přípravy, teplota by neměla být vyšší jak 40oC) - Metylcelulósy - Fibrinogenu (po aktivaci -> fibrin / fibrinová síť) - je možné použít i čistě syntetické polymery, např. metakryláty (hydrogely) Trvanlivost a uchování médií a jejich doplňků !doporučení výrobce - dodavatele! - Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20oC) - Většina složek média (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy,..) je stabilní po dobu jednoho roku při 4oC a tmě - Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je třeba ho přidávat samostatně ze zamražéné zásoby. Jeden rok při 4oC se ale ješte považuje za akceptovatelný, možno nahradit médii s Glutamax a pod. -Sérum při 4oC až 2 měsíce, při -20oC až 3 roky - Obecně při teplotách pod -70oC je vše stabilní minimálně 1 rok - Stabilita je závislá na tekutosti / zmrzlosti roztoku, což je ovlivněno složením a koncentrací rozpuštěných komponent. Např. soli a glycerol posouvá bod tuhnutí k nižším teplotám (při -20oC není 10% roztok glycerolu úplně zmrzlý) a DMSO k vyšším teplotám (tuhne už při~ +6oC) Biologické faktory - v kultuře roste ještě něco navíc než požadujeme = čistota kultury / sterilita - Jiné buněčné linie (zkreslení výsledků buněčnou specializací, dominance invazní buněčné linie = zánik původní buněčné linie) - Plísně, kvasinky, bakterie (toxiny, vyčerpání média = zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) - Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) 1. PREVENCE + MONITORING! 2. LÉČENÍ PREVENCE PROVOZ - Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor, nevětrá se přímo okny, ale pokud možno přes ventilační systém s filtrací -Pravidelně se provádí úklid a desinfekce povrchů (prostředky na bázi chloru - SAVO, Jodu - Ajatin, 70% EtOH,....) - LTC je periodicky vysvěcována germicidní (širokospektré UV) lampou - Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před vlastní prací si desinfikují ruce příslušnými prostředky (minimálně použití 70% EtOH) - S kulturami se pracuje pokud možnou pouze ve Flow-boxu MATERIÁL Čisté materiály se podle své odolnosti / vlastností sterilizují-desinfikují: (čistý z čistých surovin nebo po důkladném omytí speciálními detergenty) autoklávováním (120oC, 20-30 minut) - solné roztoky, některé pufry, agar, želatina/kolagen, některý plastik,.. suchým teplem (180oC, 3 až 4h) - sklo, vzácně některý plastik (do 120oC) zářením gama (vzácně i UV -jen povrchy) - plastik, sklo filtrováním - vzduch (HEPA filtry s póry 0,3 jim), roztoky hlavně média a séra běžně přes filtry s póry 0,2 im) omytím (2-5% aldehydy, 70% EtOH, 2-5% fenol, 5-10% peroxid vodíku,....) - nástroje, pracovní plochy, některý plastik, sklo (celkově může být málo účinné a požkozující čištěný materiál) plamenem -kovy, sklo parami alkylačních činidel -někdy kombinace s autoklávováním (etylén oxid), speciální aplikace jako dekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždy problém pro obsluhu! Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika. Kritéria pro antibiotika: - nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus buněk -musíochraňovat kulturu po celou dobu experimentu - netoxické a bezpečné pro uživatele - kompatibilní s ostatními složkami média - rozpustné v netoxických rozpouštědlech a) Ochranné proti mikroorganismům Nejčastěji penicilin/streptomycin nebo gentamycin, příležitostně tetracyklin b) Selekční (viz. Příprava transgenních linií) Neomycin (G418, geneticin), Hygromycin, Puromycin c) Speciální Mitomycin C AniJ) iotikum hkvLduje mechanismus účinku mechanismus rezistence Fenicilin (samostatne s e neužíva) G+ ISBS Peniciliti G G+ ISBS Ampicuin G+,G- Perúcilin/stieptamycin G+,G- PerricilinMreptortúcin/ neomycin G+,G- Gentamycin G+, G-, mykoplazmata IP, aminoglykosidové Kanamycin G+, G-, mykoplazmata IP, aminoglykosidové Streptomycin G+,G- IP, aminoglykosidové mutace v genu pro S 12 ribozomální protein, inaktivace prostřednictvím aminoglykosidové transferázy (Podává s e obvykle v kombinaci, kvůli vysokému riziku vzniku rezistence.) Neomycin G+,G- IP, aniinoglykosidové Paromomycin G+, G-, ň. protozoa, omezeně Jielminti IP, arninoglykosidové Spektinomycin G-, G+ (goriokoky) IP, bakteňostatický účinek strukturně podobné aminoglykosidum. mutace v genu pro ribozomální protein S5. Tyl os in G+, mykoplazmata IP, makrolidové Tetracyklín G+,G- IP ztráta permeability buněčné stěr^ MytomycinC G+,G- Isynt. DNA Polymyxin G- Polypeptid s hydroíbbním koncem, který fiinguje jako kationic ký de terge nt. V azb a na lipid A balrteriálriích LPS, vytváří póry do cytoplazmatické membrány Amphotericin B (makrolidové) Nystatin kvasinky, plísně kvasinky, plísně vazba na s teroly memb rány hub, vytváří kanály do buněčné membrány vazba na s teroly memb rány hub, vytváří kanály do buněčné membrány Přehled nejčastěji používaných antibiotik G+ ... grampozitivní bakterie G-... gramnegativní bakterie IP ... inhibuje proteosyntézu ISBS ... inhibuje syntézu bakteriální stěny MONITORING - V kultuře nebo v zásobních roztocích něco roste co tam nemá být (plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary, kulovité až vláknité, někdy řetízky) - Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na žlutou = pokles pH) - Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu - Mikroskopické barvení na celkovou DNA (zviditelnění mikroorganismů, zejména endoparaziti) - Stanovení specifických antigenů (Imunocytochemie, western blot) - Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou - Kontrolní kultivací médií samotných nebo po přídavku specifických substrátů - Výsledky experimentů nejsou reprodukovatelné / jsou chaotické - Buňky jsou citlivější ke stresu LÉČENÍ - Likvidace zasažené kultury - Kombinací antibiotik - Kultivací buněk v kompatibilním organismu (např. v břišní dutině = ascites) Chomáček plísně v kultuře Mycoplasmata -Běžným VIS mikroskopem prakticky nejsou vidět - Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána) DETEKCE (je třeba kukltivovat bez antibiotik - možné přežívání na pozadí): - Vitální barvení na DNA (Hoechst) - Detekce specifických DNA sekvencí pomocí PCR - In situ hybridizace (RNA , DNA) -Měření enzymatické aktivity, systémy s transgenními buňkami (fy. Invivogene,...) - (Inkorporace uracilu (mycoplasmata) X uridinu (eukaryontní buňky)) ZDROJE: - infikované buňky v TC! - práce se zvířaty v laboratoři TC - pracovníci laboratoř TC LÉČENÍ: - Kombinací antibiotik - Pasážováním buněk v kompatibilním organismu (ascites - volně v břišní dutině) S^mval of MG on Various Substances Cottcui . 4 days Feathers 4 days Rubber 2 days Hair 3 days Pnr 4 hniTTt: Shavii igs 8 hours Nose 1 day Wood tday Skin <4 hours Feed 4 hours Buffer 1 day Viabilita některých druhů mycoplasmat za různých podmínek Investigations into the survival of Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, and Mycoplasma iowae on materials found in the poultry house environment. N.H. Christensen, Christine A. Yavari, A.J. McBain, and Janet M. Bradbury, Avian Pathology 0994)23:127-143. Survival of MS on lances Cotton 2 days Feathers 3 days :: Rubber 8 hours Hair 8 hours Straw- ■ 12 hours : Ear 4 hours \ Shavings 4 hours Nose 12 hours Wood 12 hours ; Skin : 0 hours : Feed 0 hours Buffer ■ NT Shirnizu, T., Nagatomo, H., and Nagahama, K. Zentralblatt fur Bakteriologie (1990), Supplement 20,950-952. Survival of MG ander Various Conditions Sunlight <15 to 120 min UV light 30 - 90 min Well water with 1% serum 7 days : Well water 4 - 5 days 50% soil extract 1 ■3 days Dry at 4° C 61 days Dry at 20° C 10 -14 days; ; Afi fn 11ll min :aunilgiH. UV light tU Ij-'J llltll 30 - 60 min Well water with 1% serum 1 '2 days Well water 1 - 2 days 50% soil extract 1-2 days Dry at 4° C Dry at 20= C 51 - 77 days 10 - 2] days Obecné schéma léčení buněčných linií v LTK na mycoplasmata Příklad postupu léčení buněčné kultury na mycoplasmata přípravkem BM-cycIin fy Roche Treatment w W W W vv w rWTWlWlWTWTTTWFF 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 23 30 32 34 36 38 40 Days 1 III Iii II III Antibiotic-free Medium l 1 2 2 1 122 1122 Medium with 10 ug/ml BM-Cyclin 1 or 5 jig/ml BM-Cyclin 2 Účinnost komerčně dostupných antibiotik v léčení kultur napadených mycolpasmaty Uphoff & Drexler 2001 n - počet testovaných buněčných linií Zdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovaná mycoplasmaty (vitální barvení pomocí Hoechst 33258) MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit MycoZap™ Mycoplasma Elimination Reagent Základní vybavení laboratoře tkáňových kultur Flow-box / laminární box - základní Flow-box / laminární box - biohazard, Průtokový cytometr I Flow-cytometer (FACS) Počítaččástic - Inkubátor / termostat s regulací teploty a složení atmosféry - Flow-box = laminární box - Inverzní mikroskop, nejlépe s fázovým kontrastem (Nomarského - vnitřní struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) - plastické znázornění povrchů) -Počítaččástic (hemocytometr, Burkrova komůrka, Coulter Counter, FACS,..) - Lednice a mrazáky - Kontejner s tekutým N2 (-196oC), nebo extrémně hluboko-mrazící box (-150oCa méně) - Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor -Centrifuga - Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický) - Automatické pipety - Technické zázemí - umývárna, sklad, šatna,... BUŇKY V TC Podle způsobu kultivace - Adherentní (většina, rostou přichyceny k podkladu) - Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu) Adherentní - HaCaT Suspenzní - HL60 Podle původu a vlastností - Primokultury Buňky izolované většinou ze zdravé tkáně (obecně zdravý genom, ale většinou omezené možnosti kultivace/dělení buněk) - Permanentní linie Nejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případně ze zdravé tkáně a imortalizované (většina chyby v genomu -> nestabilita, jsou ale nesmrtelné), adaptace na podmínky in vitro!!! PROLIFERACE x DIFERENCIACE PROLIFERACE = dělení buněk Hierarchie hematopoezy HSC hematopoetickä kmenovä buhka Myeloid V— MPP multipotentni progenitor T Lymphoid 1 i Stem Cell Mullipotent progenitor myeloidni progenitor Wß 'dp CMP v lymfoidni [ ;1 progenitor MEP monocyty 1 * ^9 9 9 9 9 9 innr\/t\/ 11?* , *■--- Megakaryocyte ▼ Erythrocyte clesticky Macrophage granulocyty Eosinophil Neutrophil Basophil O CLP ¥-V Pro-B Pro-T ▼ I Pre-B - 1 ' o o o BCell TCell NKCell Committed progenitor Mature cells Dendritic Cell PRIM0KULTURY PERMANENTNÍ LINIE heterogení klon omezená životnost (H.l.) nesmrtelné Většinou náročnější na kultivaci 0becně snadno kultivovatelné variabilita izolací genetická nestabilita BUŇKY NORMÁLNÍ IMORTALIZOVANÉ NÁDOROVÉ diploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidní /polyploidní senescence / Hayflick limit nesmrtelnost nesmrtelnost Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst je nezávislý na kontaktu s posdložkou (anchorage-independent) +++/- specifické růstové faktory +/- specifické růstové faktory +/--- specifické růstové faktory netvoří nádory netvoří nádory tvořínádory RŮST BUNĚK V TC A) Buňky se v kultuře nedělí - je třeba periodicky měnit kultivační médium (terminálně diferencované, postmitotické buňky) B) Buňky se v kultuře dělí = proliferují - je třeba je pasážovat (většina buněk primokultur i permanentních linií) Pasážování - periodické „ředění buněk", obecně spojené i s výměnou média Adherentní linie* - mechanicky nebo enzymatickým štěpením vazeb buňky / substrát; buňka / buňka Enzymy - trypsin, colagenáza,..; inaktivace spec. inhibitory, vyředěním, nadbytkem proteinů (např. sérem) Podpůrné látky - EDTA (zejména vychytávání Ca2+) Suspenzní linie -prostým ředěním * Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu, na kterém rostou. Běžně se používá ošetření 0.01 - 0.1 % roztokem želatiny (prasečí, hovězí) v dH2O. Podle potřeby a typu buněk se používají ale i ostatní proteiny ECM. Pasážování buněk pomocí tzv. trypsinizace (enzymatické rozvolnění) confluentní buňky (100%) rozvolněné confluentní buňky rozvolnění buněk deplecí Ca2+ iontů (chelatony např. EDTA) růst kultury nová pasáž (confluence ~20%) I enzymaticke štepení např. trypsinem enzymaticky rozvolněné buňky (suspenze) část buněk na novou misku, do nového média Proliferaci buněk v kultuře charakterizuje růstová křivka s 3 fázemi ▲ Logaritmická (růstová) fáze fáze Čas Dále je buněčná proliferace charakterizována: Buněčná - denzita - počet buněk na ml nebo cm2 - konfluence - počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2, častěji „%" plochy) Generační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délka buněčného cyklu Doubling time - čas potřebný ke zdvojnásobení buněk v populaci Hayflick^v limit - v případě většiny primokultur počet možných děleni, buněčně specifické (senescence - stárnutí buněk, „quiescence -klid/spánek buněk") Analýza buněčné proliferace Počítáním buněk - v mikroskopu (Búrkrova komůrka / hemocytometr) -prístroji (Coulter counter - pocitaccastic, FACS - , průtokový cytometr, potreba vnitrního standardu) Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku) II Q| i i| " I " / v \t r v'°_l_l I ■ I J_" " J_ II F I ■ I _l_ I ' ' I vi \ - Inkorporace 3H thymidinu (měřise přírůstek radioaktivity, celkový, nebo u jednotlivé buňky) - Inkorporace BrdU (bromdeoxyuridinu, analog thymidinu), množství BrdU se stanoví pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce) - Celkové množství DNA v buňce -> stanovení fáze buněčného cyklu 50 100 150 200 Průtokový cytometr (Flow-cytometr I FACS) Přírůstek celkových proteinů - nepoužitelné u buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (ECM) Stanovení enzymatické aktivity (enzymy permanentních metabolických drah) - testy využívající tetrazoliové soli (např. MTT, WST-1), které jsou redukovány na barevné formazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různě citlivé pro jednotlivé enzymatické (oxidačně redukční, NADP) systémy a i vhodné pro různé typy buněk) Stanovení exprese specifických proteinů spřažených s proliferací - imunohistochemicky (jednotlivé buňky) - western blotem (celkově v populaci) (PCNA, Ki-67, cykliny, inhibitory na cyklinech závislých kináz (cyklin-dependentní kinázy),.. Nedílnou součástí sledování proliferační aktivity buněk je i detekce jejich životaschopnosti = viability, která je spojená s buněčnou smrtí = apoptózou, případně s nekrózou Analýza viability a apoptózy A) Testy založeny na kompaktnosti zdravé buňky a jejím „správném" chování / funkci - Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, ...) - Schopnost vylučovat barviva živými buňkami (eosin, bromfenolovou modř pro detekci ve VIS, propidium iodid pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS) - Enzymatická aktivita, nejčasteji esterázy (fluorescein diacetát pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS, možno kombinovat s propidium iodidem) - U adherentních buněk lze hodnotit počet adherovaných a plovoucích (mrtvých / apoptických buněk -Změny ve struktuře cytoplasmatické membrány -> anexin / fosfatidylseriny B) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrů - Fragmentace DNA (elektroforeticky = tzv. apop. žebříček DNA, in situ = TUNEL test, Comet assay) - Aktivita specifických proteáz = kaspásy, detekce fragmentace substrátů kaspás - Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2 - Kompaktnost mitochondrií (změny v polarizaci m. membrány, vylití cytochromu c) Diferenciace buněk V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme, aby si buňky dlouhodobě zachovali stabilní genotyp i fenotym. Přitom u nádorových línií je udržení stabilního genotypu už z principu problematické. Změny kultivačních podmínek mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií, ale vedou zejména ke změně fenotypu => diferenciaci, a to jak cílené tak náhodné. DIFERENCIACE JE PRAKTICKY VZDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERACNICH PARAMETRŮ, PŘÍPADNĚ I S APOPTÓZOU. Parametry analýzy diferenciace: -změny v morfologii buněk -změny v expresi genů: detekce specifických mRNA a specifických proteinů (v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy) - funkční testy (fagocyty - fagocytóza; nervy - přenos signálu, depolarizace membrány, produkce mediátorů; svaly - odpověď na stimulus, kontrakce; epitely - produkce mucinů;.....; transplantace a sledování jak se transplantované buňky zapojí do funkce dané tkáně) Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk SF / SF S+RAt S SF+flA / SF serum-free seruin-free semiii + RA '■ 1 serum sefum-free +RA: serum-free , Oj ■M Oj Oj Oj LL OJ Days of differentiation A 6 4 6 2 4 6 SF ,' SF SF í SF S+RA I S S+ft A / SF SF+FiA í s F+RA l SF serum-fiiee semín-íree ^ serum +ftA serum t setwi + RA sítum-íree h_ serum-fr^e + FJA semín-free ^ i í: i' o» S í S 1 Hí "- -í -í ů s í á í % s Ll_ "f T U. i* 01 O) tŕ> CO (í> S u. H-CAM Cytokeratin Endo-A 6 days S+BAIS S+RA ,' SF SF+RAIS SF+RAfSF RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů >uňky EC dukovanou neurální diferenciaci EC buněk ♦ buněčná jádra ♦ cytokeratin EndoA pozitivní buňky - entoderm ♦ N-CAM pozitivní buňky - neurony Diferencované buňky EC monovrstva + RA - sérum Zdroje buněk v TC A) Tkáňová banka nebo darem např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com) B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů Izolace nádoru, jeho enzymatická disociace na buněčnou suspenzi, kultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonů a jejich charakterizace v průběhu kultivace -> linie musí vykazovat dostatečnou stabilitu v průběhu kultivace, aby byla zachována reprodukovatelnost výsledků. Popis nově získané linie by měl obsahovat co nejvíce její chrakteristik. Původ (typ nádoru, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího ustanovení, charakterizace fenotypu i genotypu,..) C) Příprava primokultur z živočišných tkání Příprava myších embryonálních fibroblastů MEF - mouse embryonic fibroblast PEF - primordial embryonic fibroblast -Připravují se nejčastěji z 13.5 denních embryí (11-13.5 dpc.) - Gravidní samice se usmrtí a vypreparuje se děloha s embryi - Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány - Zbytek embrya se enzymaticky a mechanicky rozruší a po odstranění kompaktních zbytků, se suspenze vyseje na kultivační misku - Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují (~6-15 pasáží ~ 24-60 dnů, Hayflick limit) Příprava stromálních buněk kostní dřeně BMSC - bone marow stromal cells - Vypreparujeme stehenní kost, odstřihneme hlavice a propláchneme (např. injekční stříkačkou) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky (lze i kost navrtat a odsát (např. injekční stříkačkou) = možné autotransplantace). - Po 24 hodinách kultivace odstraníme médium se zbylými krevními elementy opláchneme a přidáme nové médium. - Stromální buňky postupně vytváří nepravidelné kolonie fibroblastům podobných buněk - Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny Pozn. potkaní a lidské rostou lépe jak myší Příprava myších ES buněk ES - embryonic stem, embryonální kmenové Linie ES buněk na feederu MEF Homogenní populace ES buněk Upraveno podle Kroupová 2004 Dlouhodobé uchování buněčných linií v TC Permanentní kultivace - selekce buněk s odlišnými vlastnostmi než měly ty původní - časově a finančně náročné • Empiricky je za stabilní považováno 10 - 30 pasáží v závislosti na buněčné linii a i na kultivačních podmínkách. • Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) než primokultury (zde ale nevýhoda Hayflickova limitu). • Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsou známy kultivační podmínky, kdy dlouhodobě (> 100 pasáží) v zásadě nemění své vlastnosti. Zamražování buněk Obecně v kultivačním médiu a) se zvýšeným obsahem séra (20-100%) b) se sérem (10-20-50%) s přídavkem DMSO (5-10%) c) vzácně se sérem (10-20-50%) a přídavkem glycerolu (10%) Buňky je třeba zchlazovat postupně na ~ -80oC, potésepřenesou do ultra-hlubokomrazícího boxu (~ -185oC) nebo do tekutého N2 (-196oC) k trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysoké koncentrace buněk~ >107 buněk na ml média. Postupné zchlazování - V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího boxu (~-80oC), teplota klesá rychlostí ~ 1oC za 1 minutu - Zanořováním do par N2 - V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do hlubokomrazícího boxu, po 3 hodinách k trvalému uchování - V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20oC), pak na 3 hodiny do hlubokomrazícího boxu, následně k trvalému uchování Rozmrazování buněk Buňky je třeba rychle převést z hlubokého zamražení (~ 190oC) na kultivační teplotu, opláchnout zamražovací médium (centrifugací) a vyset k další kultivaci. Druhý den po vysetí je vhodné vyměnit kultivační médium za nové a odstranit tak zbytky buněk, které zamražení/rozmražení nepřežily. Přeprava buněk - V zamraženém stavu v tekutém N2 (v termosce, lokální přeprava) - V zamraženém stavu v isolačním boxu se suchým ledem (CO2) (na velké vzdálenosti, zásilkové společnosti mývají i službu s doplňováním suchého ledu) - Živé v kultuře, v kultivační nádobce s nadbytkem média (v závislosti na buněčném typu 1 - 3 dny) - Tkáně (s výjimkou krve) se přepravují podchlazené (ne zmrzlé) ve výživných médiích, často s kryo-protektivy Synchronizace buněk v buněčném cyklu Fyzikální metody -Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur - Centrifugace (G0/G1 buňky jsou nejlehčí) a) v gradientu b) elutrace (centrifugace s protiproudem média) - FACS, sortrování pomocí flow-cytometru - Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání) Chemické metody - Deprivace růstovými faktory (sérem) - Deprivace odstraněním iso-leucinu z média - Deprivace Ca2+ -Přídavek hydroxyurei, inhibice RNA syntésy -> blok DNA syntézy - Dvojitý thymidinový blok - Mitotické jedy, inhibují reorganizaci mikrotubulů / dělícího vřeténka (kolchicin, kolcemid, nocodazol, ...) - zejména zviditelnění chromozomů, karyotipyzace Srovnání synchronizace v buněčném cyklu deprivací sérem (A) a kontaktní inhibicí (B) Příklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací sérem myší fibroblasty linie NIH/3T3 Princip dvojitého bloku přídavkem nadbytku thymidinu - nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu distal Současná kultivace více buněčných typů - Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem - Vhodné mechanické vlastnosti podkladu atd. V případě přímého kontaktu odlišení buněk na základě jejich vlastností - Exprese specifických proteinových markerů na povrchu buněk - Selekce díky expresi nějakého proteinu (enzymu, fluoreskujících proteinů,.. - Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomycinem C,.. ) Pokud je třeba maximálně minimalizovat riziko vzájemné kontaminace -Buňky v kultuře jsou odděleny polopropustnými membránami Imortalizace buněk Proč? -převedení primokultur v permanentní linie - zjednodušení kultivačních podmínek a) Spontálně - pomalé, málo účinné b) Cíleně - fyzickálními faktory: Gamma záření, Rentgenovo záření (záření X), teplota - chemickými faktory: NiCl, NiSO4, Dimethylsulphate, N-methyl-N-nitrosouera (MNU), benzo[a]pyrene diol epoxide, 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) - biologickými faktory: viry - virus Epstein Barrové, virus myší leukemie, virus Rousova sarkomu, SV40 vektory (plasmidy / viry) exprimujícími transformující protein, např. antigen SV40 large T nebo adenovirus E1A,.. Cílené genetické manipulace Změny genetické informace, vložením, poškozením nebo vypnutím genu / genů Vektory plasmidové a virové Chemicky nebo fyzikálně - viz. imortalizace Vnesení vektoru do buněk a) Infekcí-viry b) Chemicky - lipofekce: obalení vektoru s lipidy a fúze komplexu s cytoplasmatickou membránou -Ca2+ precipitace: vysrážení vektoru na povrchu buněk v komplexu s Ca2+ a jeho pohlcení buňkou endocytózou - transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený diethylaminoethylem je endocytován do buňky - transferofekce: vektor je navázán na transferin a přes transferinový receptor endocytován do buňky c) Mikroinjikace d) Elektroporace - narušení buněčné membrány elektrickým výbojem a difůze vektoru do buňky e) Nucleofekce - elektroporace v kombinaci s chemií, přenos vektoru do jádra f) Biolisticky - vektor navázaný na partikuli (zlato, wolfram) je vstřelen do tkáně, buněk Selekce buněčných klonů Adherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízké účinnosti transfekce nebo jejich konfluenci tvoří samostatné kolonie, které lze mechanicky, případně za pomoci proteáz (trypsin, kolagenáza) oddělit Suspenzní buňky pod selekčním antibiotikem je třeba rozklonovat mezním ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růst v polotekutém / viskózním médiu (agar apod.) Nejběžnější selekční antibiotika pro savčíbuňky G418 / Neomycin, Hygromycin B, Puromycin Dodatek - TKÁNĚ a ORGÁNY Tkáně umíme kultivovat / připravovat jen velice omezeně, většinou jde pouze o uchování po určitou dobu, podobně jako orgány. U orgánů je již aktuální otázka přívodu živin, kyslíku a odvodu metabolitů a CO2. Orgány je tedy třeba mít metabolicky utlumeny (podchlazením) a nebo napojeny na oběh s živinami simulující krevní zásobení. V současné době je zvládnutá problematika krve (lze zamrazit), částečně pak epidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněk pankretu (Langernhansových ostrůvků) z prasat. Velkým příslibem pro transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk. Epidermis - primokultury prasečích / lidských keratinocytů pěstované na syntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis po popáleninách apod. Částečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocyty jsou vysety do reaktoru na rozvodné potrubí z polopropustných membrán. Celý takový bioreaktor pak připomíná skutečná játra s krevní oběhem a odvodem žluči. Hepatocyty se však zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobému uskladnění a tak využití podle potřeby. Doporučená literatura: Lesko, J. a kol.: Práce s tkanivovými kulturami, Bratislava, Vydavatelstvo slovenskej akademie ved 1975, s. 212. Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem, Espero Publishing 1998, 630 s. Alberts, B. a kol.: Molekular biology of the cell. New York & London, Garland Publishing, Inc. 1994, 1294 s. Spector, D. L. a kol.: Cells. A laboratory manual. Volumes 1, 2, 3. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998, 3 197 s. Cellis, J. E. a kol.: Cell Biology. A laboratory handbook. San Diego, London, Academic Press Inc. 1994, 1714 s. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 1832 s. Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc. 1995, 728 s.