Experimentální uspořádání při hybridizacích Č.3 Hybridisace v roztoku, na pevném podkladu, in situ hybridizace a jejich využití Experimentální uspořádání u hybridizací • •Hybridizace se mohou provádět •(1) v roztoku •(2) na pevných podkladech •(3) v preparátech buněk či tkání (in situ) •Obr. . •. Hybridizace v roztoku •V tomto experimentálním uspořádání jak cílová nukleová kyselina tak sonda volně interagují v reakční směsi, což urychluje tvorbu ds molekul •Postačuje relativně malé množství vzorku Optimální výsledky jsou dosahovány •S dostatečně purifikovanou DNA •A se sondou, která nevytváří vlásenky Vzorek obsahující hybridisované molekuly •Lze vystavit působením S1 nukleázy, která je specifická pro ss DNA a neštěpí ds DNA •ds DNA může být ve vzorku stanovena kvantitativně po precipitaci kys. trichloroctovou nebo po navázání na hydroxyapaptitové kolonky, na něž se váže ds DNA. Hybridizace v roztoku se dá použít •Ke stanovení počtu kopií specifického genu – Obr. •K subtraktivní DNA/RNA hybridisaci, která umožňuje zjistit rozdíly v transkripci genů příbuzných buněk např. T a B lymfocytů – Obr. • Přísné podmínky hybridizace •Umožňují vytvoření duplexů z jednořetězců, jejichž sekvence jsou zcela komplementární nebo mají vysoký stupeň podobnosti •Teplota, při níž hybridizace probíhá je asi o 5ºC nižší než je Tm. Tvorba dvouřetězců •Je ovlivněna tím, zda vzájemně hybridizují molekuly DNA nebo RNA. •Stabilita hybridů klesá v pořadí: •RNA/RNA •RNA/DNA •DNA/DNA Provádění hybridizace za méně přísných podmínek •Pokud není sekvence sondy plně komplementární k vyhledávané sekvenci (např. při vyhledávání příbuzných sekvencí), provádí se hybridizace za málo přísných podmínek •Těch se dosáhne snížením teploty hybridizace (asi 40ºC pod hodnotu Tm) K hybridizaci může dojít •I v případě, je-li v roztoku sonda imobilisovaná na pevný nosič (např. paramagnetickou kuličku) •Využívá se v DNA diagnostice Hybridizace na pevných podkladech •Jsou nejvíce používány Rozlišujeme •3 základní typy hybridizace na pevných podkladech •Hybridizace kolonií nebo fágových plak •Tečková (kapková) či čárková hybridisace •Hybridizace po přenosu NK na membránu • Hybridizace kolonií nebo plak •Na membránu se přenáší nukleové kyseliny bezprostředně uvolněné z bakteriálních kolonií nebo plak bakteriofágů vyrostlých na agarových miskách •Obr. • Tečková (kapková) hybridizace •Na hybridisační membránu je nanášen vzorek denaturované nukleové kyseliny ve formě kapek nebo čárek (dot blot, slot blot hybridisace) • • Hybridizace po elektroforetické separaci nukleových kyselin a přenosu na membránu •Nukleové kyseliny jsou zachyceny na membráně v místech odpovídajících jejich polohám v gelu po elektroforéze. •Denaturovaná DNA nebo RNA se přenáší na pevný podklad (nitrocelulózový filtr, nylonová membrána) • • Podle toho, jakým způsobem k přenosu NK na membránu dochází rozlišujeme •Kapilární přenos – NK jsou unášeny pufrem prostupujícím gelem a hybridisační membránou •Pohyb pufru je zajištěn kapilárními silami, které vyvolává savý materiál navrstvený na membránu •Obr. Elektroforetický přenos •Je podmíněný vlivem elektrického pole. Používá se zejména při přenosu nukleových kyselin a proteinů z polyakrylamidových gelů Vakuový přenos •Gel je položen na membránu umístěnou na pórovité podložce a přelit roztokem, který je pak nasáván pumpou. •Výhodou je zejména rychlost přenosu. • Podle typu přenášených molekul se rozlišuje •Přenos DNA neboli Southernův přenos (podle E.M. Southerna) •Přenos RNA neboli northernový přenos (slovní hříčka) •Přenos proteinů neboli westernový přenos Po přenosu •Jsou molekuly NK irreverzibilně navázány na membránu (jednořetězce přístupné sondě) Hybridizace se sondou •Zahrnuje následující kroky: •Prehybridizaci (přídavkem vhodných látek – heterologní DNA, tRNA, proteiny) se obsadí volná místa na membráně a zabrání se tak nespecifickému navázání sondy •Vlastní hybridizaci – po aplikaci roztoku se sondou •Promývání (odmyje se nenavázaná sonda) •Detekce navázané sondy (podle způsobu značení např. imunochemicky (s využitím protilátky) Detekce specifického restrikčního fragmentu DNA •po Southernově přenosu na membránu Obr. • Rehybridizace •Vzorky na membráně lze po odmytí sondy podrobit opakované hybridizaci s dalšími sondami •Tento postup se označuje jako rehybridizace. Použití DNA/RNA hybridisace •K určení nekódujících úseků DNA (intronů) ve fragmentu DNA •Obr. Využití DNA/DNA hybridisace pro RFLP analýzu •Obr. • Hybridizace in situ •Umožňuje detekovat přítomnost specifických NK na sklíčku tj. v cytologických preparátech chromozomů, buněk nebo v řezech tkání •A s vysokou přesností stanovit jejich prostorovou lokalizaci • Metodu lze použít •Pro detekci genů na polyténních chromosomech hmyzu •Na metafázních chromosomech savců a rostlin •Pro lokalizaci interfázních chromosomů v b. •Pro detekci specifických molekul mRNA uvnitř buněk a tkání Identifikace mRNA pomocí •In situ hybridisace – Obr. •Původně byly sondy značeny radioaktivně a jejich detekce byla prováděna aiutoradiograficky • FISH •Fluorescentní in situ hybridisace •Sondy jsou přímo značeny fluorescenčně značenými nukleotidy •Vizualizace navázaných sond se provádí fluorescenční mikroskopií • Použitím specifických sond •Označených různými fluoreskujícími látkami lze např. na 1 chromosomu identifikovat polohy několika genů současně •K znázornění dalších morfologických struktur se preparát obarví běžnými barvivy používanými v cytologii •Obr. • ? Dát do přednášky č. 2 Faktory ovlivňující stabilitu hybridů •Zejména teplota •Délka hybridizujících molekul •Stupeň vzájemné komplementarity bazí •Zastoupení GC a AT párů •Koncentrace solí v roztoku •pH roztoku •Přítomnost látek destabilizujících vodíkové vazby mezi řetězci (např. denaturační činidla jako je formamid nebo močovina)