Mikročipy . Mikročipy, mikrouspořádání, microarray •Nová technologie využívající hybridisace – pro studium genové exprese •Na mikroskopickém sklíčku jsou ukotveny ve velkém počtu krátké oligonukleotidy (např. 80 x 80), •které reprezentují všechny geny organismu •současně jsou hybridizovány s molekulami cDNA (radioaktivně nebo fluorescenčně značenými) •Hybridisace je detekována pomocí laseru s vysokou rozlišovací schopností Mikročipová analýza umožňuje • •Zjistit, které geny se exprimují •identifikovat sady genů, které reagují stejným způsobem na určitý podnět (např. změna teploty jiná změna prostředí) •zjistit, které geny jsou exprimovány, indukovány nebo reprimovány v závislosti na buněčném cyklu, fázi vývoje apod. •Sada genů, jejichž exprese se zvyšuje nebo snižuje vlivem stejných podmínek, má pravděpodobně stejnou funkci •Určitý typ genové exprese může indikovat abnormální buněčnou regulaci (např. při určitém onemocnění) •Intenzita měřeného signálu je úměrná množství transkriptu v populaci RNA • • • Zpětná (reverzní) hybridizace •Soubor neznačených oligonukleotidů (sond) je imobilizován na pevném podkladu, k nimž hybridizuje vzorek obsahující testovanou značenou DNA. •(Značeny mohou být ukotvené oligonukleotidové sekvence a k hybridizaci může být použita mRNA nebo DNA) • Kroky v čipové analýze genové exprese •1. konstrukce čipu •2. příprava sondy •3. hybridizace sondy s čipem •4. snímání a detekce hybridisačních produktů •5. normalizace a analýza dat 1. Konstrukce čipu •Dvě základní technologie •- nakapávání DNA fragmentů (oligonukleotidů) na čip (podložní sklíčko) •- syntéza oligonukleotidů přímo na čipu Nakapávání na čip •nakapávají se PCR produkty (po amplifikaci genomové DNA), cDNA (po reverzní transkripci mRNA), oligonukleotidy (chemicky syntetizované) • Nakapávání s využitím speciálně konstruovaných zařízení • •Pomocí jehly (tvar a hustota nanesených kapek jsou dány průměrem a tvarem jehly a viskozitou roztoku) •Pomocí kličky a kroužku (kličkou se dávkují kapičky, kroužek je udržuje) výhoda: do kapek lze použít různé monožství DNA •S využitím principu inkoustové tiskárny (umožňuje zmenšení objemu kapky na pl) • Syntéza přímo na čipu •Oligonukleotidy jsou syntetizovány na pevném nosiči – sklíčku (využívá se fotolitografických předloh nebo bezmaskové technologie spolu s fotodeposiční chemií) •Jsou dlouhé 15-25 bp •Různé sekvence představují jednotlivé geny •Lze analyzovat malá množství transkriptů •Eliminovat šum a falešně pozitivní výsledky • 2. Příprava a detekce sondy pro analýzu mRNA •syntetizuje se biotinylovaná cDNA, provede se hybridizace, hybridisační produkt je detekován pomocí avidinu s přikonjugovaným fluoroforem (cyanin, Cy5, Cy3, fluorescein, rhodamin) •Použití většího počtu barviv pro značení umožňuje současné srovnání přítomnosti různých mRNA v analyzovaném vzorku • 3. Hybridizace sondy s čipem •Podmínky hybridizace nejsou pro jednotlivá místa čipu stejné z důvodu různých sekvencí imobilizovaných nukleotidů •Volí se taková stringence (teplota a koncentrace solí), která dává dostatečně intenzivní signály odlišitelné od slabších signálů v případě hybridizace s částečně komplementární sekvencí •Součástí čipu jsou kontrolní RNA transkripty •Relativní množství jednotlivých transkriptů v analyzovaném a kontrolním vzorku je stanoveno podle intenzity signálů detekovaných pro jednotlivé fluorofory s přihlédnutím k rozsahu signálních poruch. 4. Snímání a detekce hybridizace •Krycí sklíčka jsou po hybridizaci snímána a vizualizována pomocí různých typů čtecích zařízení – CCD kamery, nekonfokální a konfokální laserové skenery např. ScanArray 3000 •Obrazy jsou analyzovány s určitým cílem •(Zjistit expresní úroveň jednotlivých genů •Identifikovat rozdílně exprimované geny apod.) • a •K tomu se používají počítačové programy např. GenePixPro 3.0.5. nebo ScanAnalyse 5. Normalizace a analýza dat •Provádí se normalizace relativních intenzit fluorescence v každém ze snímaných kanálů (Cy3, Cy5) •Analyzují se výsledky 3 a více nezávislých experimentů •Variabilita se stanovuje po zhodnocení šumu •Stanoví se reprodukovatelnost u jednotlivých duplikovaných genů na daném čipu Lze očekávat •Že se měřitelné změny v expresi projevují u stovek genů •K identifikaci a třídění genů podobně exprimovaných (tzv. klastry genů) se používají počítačové programy např. Cluster nebo Tree view •Získáme tzv. klastrové algoritmy mikročipové analýzy • • Mikročipová analýza umožňuje •detekovat globální změny v transkripci genomu, •avšak neposkytuje informaci o hladinách proteinových produktů, jež mohou být regulovány na úrovni translace. K tomu se využívá dvourozměrná gelová elektroforéza. Mikročipová analýza umožňuje provádět •srovnávací genomiku •Genotypizaci •Diagnostiku V mikrobiologii •Se využívají tzv. diagnostické čipy •Pro identifikaci různých baktérií např. v klinickém materiálu Konstrukce DNA mikročipu Lactococcus lactis IL1403 •Vychází ze sekvence kompletního genomu tohoto kmene •Genom obsahuje 2310 ORF (otevřených čtecích rámců) s průměrnou délkou 900 bp •370 paralogních rodin (vznikly duplikací) •Když se nebraly v úvahu tyto duplikované geny a IS elementy, zůstalo 1920 ORF Při konstrukci mikročipu byly využity PCR produkty •Nejprve bylo pečlivě pro každý specifický ORF navrženo a syntetizováno 1920 párů primerů •Na 5´konec primerů byla přisyntetizována univerzální sekvence 15 nukleotidů •PCR reakce proběhla v mikrotitrační destičce v objemu 100 ul •První PCR byla provedena s 10 ng genomové DNA •Druhá PCR byla provedena s 5 ul 40x ředěných PCR produktů a s C12-NH2 modifikovanými univerzálními primery •Úspěšně bylo amplifikováno 96% genů (z 1920) PCR produkty • byly purifikovány a pečlivě kovalentně imobilizovány na skleněné sklíčko (0.6 nl kapky na ploše 1.8 x 1.8 cm, 15x15 kapek vzdálených 200 mikronů). •Jako kontrola byla použita sada arteficierních genů jako univerzálních referenčních genů • Hybridizaci lze provádět •Pomocí značené cDNA získané z buněk Lactococcus lactis •Lze sledovat expresi jednotlivých genů Kromě DNA čipů se konstruují •Proteinové (peptidové) čipy – interakce proteinů •Imunočipy (imobilizované protilátky) k vyhledávání cílových buněk • Výsledek čipové analýzy •. Různá zabarvení v jednotlivých místech čipu Geny klasifikujeme podle funkce •Paralogy jsou velmi podobné geny, kódující příbuzné biologické funkce. Vznikly pravděpodobně genovou duplikací. Sekvenční podobnost je často indikátorem stejné biochemické funkce. •Ortology jsou geny, které kódují proteiny, které jsou identické ze 60 až 80%. Dva enzymy, které provádějí stejnou biochemickou reakci, nemusí být evolučně příbuzní.