Možnosti využití magnetických nosičů v molekulární diagnostice mikroorganismů Doc. RNDr. Alena Španová, CSc. Doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. Ing. Daniel Horák, CSc. Studenti magisterského studia Pro řadu oborů je důležitá identifikace: nvirů nbaktérií nhub nparazitů n n nv reálných vzorcích a v krátkém čase. n Molekulárně diagnostické metody používané pro průkaz mikroorganismů : nnekultivační nzaloženy na detekci specifických molekul (antigeny, proteiny, nukleové kyseliny, polysacharidy, lipidy) nlze je použít pro identifikaci nekultivovatelných mikroorganismů n Molekulární diagnostika splňuje nároky kladené na diagnostiku : nvysokou specificitu nvysokou citlivost njednoduchost nrobustnost Prognóza vývoje molekulární diagnostiky: ndynamicky se rozvíjející njedním z kritérií hodnocení rozvoje je objem prodeje přípravků (Glick a spol. 2003) Přípravky Rok/109 USD 1999 2003 2008 Imunodiagnostické 7,7 8,5 9,3 DNA diagnostické 0,5 0,75 2,0 Nové trendy: nvývoj nových postupů je založen na využití známých principů: interakce antigen-protilátka, hybridizace NK, PCR nautomatizace (robotizace) postupů analýzy nminiaturizace nuplatnění nacházejí imobilizované systémy s využitím magnetických nosičů Základní kroky v přípravě imobilizovaných systémů: nvýběr nosiče a jeho matrice nvolba afinitního ligandu (funkční skupiny) – dle povahy molekuly, kterou chceme izolovat nimobilizace ligandu na nosič Magnetické nosiče: ntuhé částice (nosiče) s magnetickou komponentou nmagnetické jádro (oxidy železa) je obaleno nosičem během syntézy nčástice jsou paramagnetické – magnetické vlastnosti se projevují pouze v přítomnosti vnějšího magnetického pole, v suspenzi nedochází k jejich shlukování npoužití vsádkovým způsobem n Jako nosiče se používají: npřírodní polymery nsyntetické polymery nanorganické nosiče – sklo, silikagel, oxidy železa nporézní, neporézní nrůzné velikosti: μm – rychlost sedimentace, pipetování, nm – nemusí se promíchávat (Brownův pohyb) Magnetické polystyrenové nosiče Dynabeads (částice 4,5 μm a 2,8 μm) Snímek1a Snímek2a obr-13 Magnetický poly(2-hydroxyethylmethakrylátový) nosič (Horák D. a spol. 2001) obr-14 obr-15 EM fotografie maghemitu (Rittich B. a spol. 2004) Magnetický P(HEMA-co-GMA) nosič (Španová A. a spol. 2004) obr-2 Ligand určuje charakter použití nosiče: Nejčastěji se vyskytující afinitní konstanty u některých afinitních párů: Vazebná bílkovina Cílová molekula KD (M-1) Avidin Biotin 10-15 Streptavidin Biotin 10-15 Receptory Hormony, toxiny apod. 10-9-10-12 Protilátky Antigeny 10-7-10-11 Transportní proteiny Vitaminy, cukry apod. 10-6-10-8 Lektiny Sacharidy 10-3-10-6 Enzymy Substráty 10-3-10-5 nmusí obsahovat vhodnou skupinu, pomocí níž je imobilizován na nosič nmusí mít dostatečnou afinitu pro izolovanou látku (afinitní konstanta K=10-4 – 10-8) Afinitní ligandy v molekulární diagnostice: ncelé buňky nprotilátky nenzymy noligonukleotidy nstreptavidin, biotin nlektiny, sacharidy nbarviva nnízkomolekulární látky (EDTA nebo IDA) n Způsoby imobilizace ligandu na nosič: nfyzikální adsorbce (nekovalentní připojení) - snadná, rychlá, bez poškození ligandu, vymývání nchemická vazba (kovalentní) – umožňuje imobilizovat různé makromolekuly – protilátky, proteiny, nukleové kyseliny n Důležitá je stérická přístupnost ligandu pro izolovanou buňku (molekulu): npřístupnost lze zvýšit orientovanou imobilizací (např. protilátky) npoužitím mezerníku obr-3 obr-4 Odstranění stérické překážky použitím raménka (Šafařík a spol. 1999) Stérická překážka u imobilizovaného enzymu a její odstranění obr-1 Imobilizované systémy s magnetickými nosiči nacházejí v molekulární diagnostice uplatnění: n1. při přípravě vzorků k analýze n2. jako součást detekčních systémů n3. jako nosiče katalyzátorů 1.Příprava vzorků k analýze Izolace mikrobiálních buněk: nbuňky bakteriální nSalmonella nE. coli O157 nListeria monocytogenes Imunomagnetická separace buněk (IMS) n IMS buněk ze vzorku obsahujícího inhibitory PCR pomocí protilátek navázaných na povrch nosiče. IMS umožňuje izolaci subletálně poškozených buněk a nekultivovatelných buněk. Použití magnetických kuliček antiSalmonella pro izolaci buněk Salmonella obr-7 obr-16 obr-17 obr-18 Vazba buněk na protilátku imobilizovanou na nosiči (Horák D. a spol. 2003, Španová A. a spol. 2003) Ukázka magnetického nosiče, separátoru a jeho použití Izolace eukaryotních buněk: nkrevní leukocyty nT a B lymfocyty ngranulocyty nmonocyty nmakrofágy nNK buňky nnediferencované buňky - hematopoetické progenitorové buňky nhybridomy ntransfekované buňky obr-1 (2) Imunomagnetická separace eukaryontních buněk (Dynal) Izolace makromolekul: nizolace mRNA z eukaryntních buněk s využitím imobilizovaného oligo (dT)25 nizolace cílových sekvencí ssRNA a ssDNA s využitím oligonukleotidů specifické sekvence, nabohacení nPro izolaci rekombinantních proteinů s His značkou lze použít magnetické nosiče s imobilizovanými cheláty (komplexy) kovů (Co, Zn, Cu) n n Izolace specifických molekul ssRNA (Dynal) Izolace mRNA z hrubých lyzátů buněk (Dynal) obr-1 (3) obr-9 Izolace DNA v kvalitě vhodné pro PCR s magnetickými nosiči pokrytými karboxylovými skupinami nv přítomnosti NaCl a PEG nizolace genomové DNA z hrubých lyzátů buněk npurifikace PCR produktů (před sekvencováním, RFLP) Izolace bakteriální DNA z HL buněk z lyofilizátů pomocí FH46-COOH nosiče a její amplifikace v PCR (Petrová 2004,DP) Tab. Množství DNA eluované z 10 μl nosiče Obr. Gelová elektroforéza PCR produktů. Běh č. 1 DNA standard, běh č. 2-10 specifické PCR produkty obr-1 (16)tab obr-1 (16)obr Molekulární typizace genomové DNA separované s využitím nosiče FH46-COOH (Španová A. a spol. 2003) obr-12 Obr. Gelová elektroforéza RAPD produktů různých kmenů hub. Běh č. 7 a 14 DNA standard. 2686 1300 1000 500 100 bp 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Bajkalské sedimenty n nCharacteristics of analysed samples and the effect of DNA isolation procedure n on PCR course n n n (ii) - Soil DNA Isolation Kit, (iiii) - Soil DNA Isolation Kit with additional DNA purification by carboxyl-functionalised magnetic P(HEMA-co-EDMA) microspheres. DNA isolation and PCR: +++, ++, +, +/- denote bands of very high, high, good, and weak intensity; - no band. t-1 Bajkalské sedimenty n nA scanning electron micrograph of magnetic nonporous P(HEMA-co-EDMA) microspheres f-2 Bajkalské sedimenty n nSchéma oxidace magnetických P(HEMA-co-EDMA) mikročástic f-1 Bajkalské sedimenty – PCR, univerzální primery n nAgarose gel electrophoresis of PCR products amplified from DNA extracted using kit and carboxyl-functionalised magnetic P(HEMA-co-EDMA) microspheres. nLanes 1-10: samples from different locations and depths of Lake Baikal, nlane 11: DNA standard (100 bp ladder), nlanes 12-14: DNA isolated using the kit without the step of DNA repurification with magnetic microspheres, nlanes 15-19: amplicons amplified from bacterial weight DNA standards (5 ng, 500, 50, 5 pg, and 500 fg). f-3 Bajkalské sedimenty – PCR, psychrotrofní n nAgarose gel electrophoresis of PCR products amplified from DNA isolated using carboxyl-functionalised magnetic P(HEMA-co-EDMA) microspheres. nLanes 1-5: Selenga Delta samples from 0-10, 10-20, 20-30, 30-40, and 40-50 cm depths, respectively; nlanes 6 and 7: DNA standard (100 bp ladder); nlane 8: psychrotrophic Bacillus cereus CCM145 control DNA (10 ng); nlane 9: mesophilic B. thuringiensis CCM19T control DNA (10 ng); nlanes 10 and 11: psychrotrophic B. mycoides strains isolated from Baikal Lake sediments at 0-10 and 20-30 cm depth (10 ng); nlane 12: negative control (water instead of DNA); nlanes 13 and 14: DNA from Baikal Lake sediment samples (Selenga Delta, 0-10 cm) isolated using the kit or phenol extraction, respectively (without the step with magnetic microspheres). f-4 2. Magnetické nosiče jako součást detekčních systémů – jako ligand se používá streptavidin, na který se váže: nkomplex buňky s biotinylovanou protilátkou nbiotinem značená DNA obr-19 Ing. Jaroslava Turková, DrSc., prof. M. Wilchek Využití nosiče s imobilizovaným streptavidinem při izolaci biotinylované DNA (Dynal) obr-1 (7)1 obr-1 (6) Izolace komplexu buňka-biotinylovaná protilátka s využitím nosiče s imobilizovaným streptavidinem (Dynal) Biotinem značená DNA navázaná na nosič se streptavidinem může být použita: npro sekvencování npro přípravu sondy (značení ssDNA) npro izolace proteinů vázajících se na DNA npro vyhledávání specifických fragmentů DNA npro přípravu syntetického genu n obr-1 (7) Příprava jednořetězcové DNA sondy (Dynal) obr-1 (8) Izolace proteinů vázajících se na DNA (Dynal) obr-1 (9) Využití biotinylovaných DNA sond při vyhledávání specifických fragmentů DNA (Dynal) obr-1 (10) Příprava syntetického genu s využitím imobilizovaného systému (Dynal) 3.Magnetické nosiče jako nosiče katalyzátorů Imobilizací enzymu na nosič vznikne heterogenní katalyzátor: nsnadno oddělitelný z reakční směsi nmožnost okamžitého ukončení reakce nmožnost opakovaného použití Příklady využití imobilizovaných enzymů: nImobilizovaná RNáza A obr-8 Obr. Gelová elektroforéza plasmidové DNA Štěpení bakteriální RNA v nepurifikovaném vzorku plazmidové DNA pomocí imobilizované RNázyA (Rittich a spol. 2000) obr-5 A) RNA neštěpena B) RNA štěpena Chromatografická purifikace plazmidové DNA pUC 19 (Rittich a spol. 2000) Příklady využití imobilizovaných enzymů: nImobilizovaná DNáza I Aktivita imobilizované DNázy I při štěpení vysokomolekulární DNA (Rudolf I. 2001, DP) obr-1 (11) Příklady využití imobilizovaných enzymů: nImobilizovaná proteináza K obr-1 (12)obr Obr. Gelová elektroforéza PCR produktů Použití imobilizované proteinázy K při štěpení vnitrobuněčného inhibitoru PCR v hrubém lyzátu buněk terénního kmene Salmonella (Prodělalová J. 2001, DP) obr-1 (12)tab 429 bp Příklad využití imobilizovaného systému – IDA, EDTA nImobilizované komplexy lanthanoidů při štěpení plazmidové DNA obr-1 (15) Stěpení plasmidové DNA imobilizovaným komplexem Nd3+ (Rittich a spol. 2004) Obr. Gelová elektroforéza plasmidové DNA pBR322 Běh č. 1-7 štěpení 0-180 min. při 63°C, č.9-15 kontrola, č.8 DNA marker, č. 16 pBR322/EcoRI oc lin ccc Závěr: n Magnetické nosiče bývají řazeny mezi tzv. inteligentní částice, jelikož mění své vlastnosti změnou vnějších podmínek – magnetického pole. Pro svou schopnost reagovat na změnu prostředí bývají tyto částice rovněž nazývány částicemi 3. tisíciletí.