CYTOGENETICKÉ METODY •analýza mikroskopické struktury chromozomů •pojem „chromozom“ - 1888 Wilhelm Waldeyer •chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton, Thomas H. Morgan •studium chromozomů: karyologie, cytogenetika •karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent chromosom Struktura metafázního chromozomu CYTOGENETICKÉ METODY •analýza mikroskopické struktury chromozomů •pojem „chromozom“ - 1888 Wilhelm Waldeyer •chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton, Thomas H. Morgan •studium chromozomů: karyologie, cytogenetika •karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce •klasifikace typu chromozomů podle polohy centromery: –metacentrický, submetacentrický, subtelocentrický, akrocentrický, telocentrický Historie cytogenetiky •role významných technologických inovací - v moderní éře 4-5 takových průlomových momentů: 1objev hypotonického působení ® rozprostření metafázních chromozomů 2kultivace leukocytů periferní krve a fibroblastů 3metody proužkování chromozomů 4metody hybridizace in situ (ISH) 5využití imunochemických metod spolu s ISH ® možnost neradioizotopové detekce hybridizovaných sond (NISH) pomocí různých fluorochromů („chromosome painting“) 1výběr tkáně s vysokou mitotickou aktivitou •kořenová čepička, embrya, larvy, regenerující tkáně •dospělí obratlovci: kostní dřeň, ledviny, slezina, gonády, intersticiální epitelium, epitelium rohovky •někdy stimulace subkutánní, nebo intraperitoneální injekcí fytohemaglutininu, výtažku z líčidla amerického nebo aktivované suspenze kvasinek Příprava mitotických preparátů 2zastavení mitotického dělení in vivo, nebo in vitro •cytostatikum: kolchicin, kolcemid, vinblastin •in vivo: výhoda - levnější, jednodušší • nevýhoda - nutnost usmrcení organismu •in vitro: kultivace periferní krve (krátkodobá) a fibroblastů (dlouhodobá) • výhoda - možnost synchronizace mitotického dělení ® snížení variability v kondenzaci chromozomů, zvýšení kvality preparátu, snížení spotřeby cytostatika – Příprava mitotických preparátů 3hypotonizace buněk •destilovaná voda, nebo 0,075 M KCl 4fixace •„Carnoyova směs“ = metanol : kyselina octová (ledová) 3:1 •několikrát vyměnit •pro skvašové preparáty místo metanolu etanol 5zhotovení preparátu •v zásadě 2 základní techniky: •skvaš („squash“ = rozmačkání): macerace nebo jemné rozemletí kousků tkáně na podložním skle a rozmáčknutí silikonovým krycím sklem •nakapání („splash“): buněčná suspenze nakapána Pasteurovou pipetou z výšky na podložní sklo ® roztáhnutí chromozomů povrchovým napětím; po nakapání buď vyschnutí na vzduchu („air-dried“), nebo zapálení suspenze („flame-dried“) kultivace Kultivace krve Příprava meiotických preparátů •testes, pylové matečné buňky •hypotonizace citronanem sodným, postup obdobný jako u mitotických preparátů •průběh meiózy a význam jednotlivých stadií; synaptonemální komplexy (SC), štětkovité (lampbrush) chromozomy Proužkování chromozomů („banding“) •Q-, G-, R-, C- proužkování •AgNOR •fluorescenční barvení: chromomycin A3, Hoechst 33258, DA/DAPI •specifická barvení: diferenčně-replikační proužkování = BrdU (bromodeoxyuridin) •použití restrikčních endonukleáz Proužkování chromozomů („banding“) •Q-proužkování (quinacrine): •diferenciální excitace a extinkce fluorochromu v závislosti na zastoupení AT bází •barvení chinakrinem, UV světlo Þ krátká doba viditelnosti mechowi_Q Proužkování chromozomů („banding“) •G-proužkování (Giemsa): •účinek denaturačních činidel na stabilitu proteinových a nukleových složek chromatinu •pozitivní (tmavé) proužky » oblasti (izochory) bohaté na AT báze •působení trypsinu (chymotrypsin, NaOH) •barvení Giemsou mechowi_G Cryptomys mechowi Sorex araneus Sorex_G2 Anicka_G Homo sapiens Lemur catta_R Proužkování chromozomů („banding“) •R-proužkování (reverse): •denaturace při alkalickém působení za vysoké teploty (80-90°C) a následná renaturace DNA •tmavé proužky » oblasti bohaté na GC báze •barvení Giemsou nebo akridinovou oranží Lemur catta Proužkování chromozomů („banding“) •C-proužkování (constitutive heterochromatin): •postupné působení silné kyseliny (1M HCl) a zásady (Ba(OH)2) a renaturaci heterochromatinu v solném pufru (2´SSC) za vysoké teploty (60°C) •rozpuštění euchromatinu •barvení Giemsou (vizualizace satelitní DNA) kolčava a hranostaj myvalovec_C lasice_C mechowi_C mývalovec kuní Proužkování chromozomů („banding“) •Ag-NOR •želatina + kyselina mravenčí, barvení AgNO3 •barvení organizátorů jadérek (pouze aktivní) • Cryptomys mechowi kolcava_NOR mechowi_NOR kolčava Proužkování chromozomů („banding“) •BrdU: •replikace za přítomnosti umělého prekurzoru (5-bromo-2´-deoxyuridin) ® sledování výměn sesterských chromatid 2_11 Proužkování chromozomů („banding“) •C-proužkování (constitutive heterochromatin): •postupné působení silné kyseliny a zásady a renaturaci heterochromatinu v solném pufru (2´SSC) za vysoké teploty •barvení Giemsou (vizualizace konstitutivního heterochromatinu) Cryptomys mechowi Fluorescence in situ hybridization (FISH) • hybridizace chromozomů in situ se značenou sondou možnost použití i několika sond současně (až 7) u FISH sondy značené biotinem • vizualizace: protilátky specifické pro biotin (avidin, streptavidin), které jsou konjugovány buď s fluorochromem (např. fluorescein izothiokyanát, FITC), nebo s enzymatickými činidly (např. alkalinfosfatáza, peroxidáza) reakce se specifickým substrátem CISS, chromosome in situ supression hybr., PRINS, primed in situ labelling, GISH, whole genome in situ hybridization, FACS, fluorescence activated cell sorting, vybarvování chromozomů = „chromosome painting“ 799px-FISH_(Fluorescent_In_Situ_Hybridization) FISH_(technique) Urovysion_on_Duet Bcrablmet FISHchip