ELEKTROFORÉZA
enzymů a neenzymatických bílkovin
•Do konce 50. let genetická proměnlivost v populacích studována pouze na základě mendelovských
morfologických znaků nebo polytenních chromozomů  ®  otázka, do jaké míry tyto jevy reprezentují
skutečnou míru genetické proměnlivosti v přírodě
•
•substituce aminokyselin (možno zjistit sekvencováním proteinů - to ale problematické):
z 20 AA 3 nesou kladný náboj (Arg, Lys, His), 2 záporný náboj (Asp, Glu)
•elektroforéza: z řečtiny = transport pomocí elektřiny
obecně = pohyb nabitých částic v médiu vlivem elektrického pole
•kromě náboje i velikost a konformace makromolekuly (-S-S- můstky, van der Waalsovy síly, vodíkové
vazby, elektrostatické síly); pH pufru
•stabilizace el. náboje - specifický pufr s vysokou iontovou silou a pH co nerozdílnější od pI
daného proteinu: pH 3-10, nejčastěji 6,5-9,5
•náboj většiny proteinů při pH 8-9 záporný ® migrace k anodě

•Princip ELFO znám již od konce 19. stol.
•1937 - Thisselius: metoda „pohyblivého rozhraní“
•1949 - Linus Pauling: papírový nosič - abnormální Hb srpkovité anémie
•1955 - O. Smithies: škrob
•1957 - Hunter a Moeller: užití katalytických shopností enzymů (histochemické barvení)
•1966 - aplikace ELFO na přírodní populace: Harry Harris (člověk), Richard Lewontin a John Hubby
(octomilka)
•
•Úroveň genetické proměnlivosti v přírodních populacích:
–20-50% lokusů polymorfních
–průměrná heterozygotnost: savci - ca. 5%, bezobratlí a rostliny - 15-20%
•
•Nosiče (média):
•škrob (starch gel el., SGE): velikost molekuly + velikost náboje
•celulózoacetát (CAGE): náboj
•agar, agaróza (AGE): náboj
•polyakrylamid (PAGE): velikost molekuly + náboj
Elektroforéza

Metody elektroforézy
•horizontální
•vertikální
•kapilárová
•
•
Elektroforéza
3_1 3_2

Metody elektroforézy
1ELFO v kontinuálním pufru
2ELFO v diskontinuálním pufru (multifázická ELFO):
•2 gely o různých koncentracích - koncentrující a separující
•na rozhraní „sendvičování“ proteinů mezi „vedoucím“ a „taženým“ iontem; pokud jen tento krok =
izotachoforéza
3Izoelektrická fokusace (isoelectric focusing, IEF):
•v gelu syntetické polyamino polykarbonátové skupiny = nosné amfolyty s rozsahem pI
•připojením el. pole ®  stabilní gradient pH; amfolyty drženy v gelu silnou kyselinou při anodě a
silnou zásadou při katodě
Elektroforéza

4ELFO v močovině a SDS:
•SDS = sodium dodecyl sulphate (= aniontový detergent):
schopnost rozpouštět některé proteiny a štěpit některé polymery
SDS způsobuje silný záporný náboj proteinů         migrace jen podle hmotnosti molekuly
•močovina: podobně jako SDS, ale náboj proteinů normální - migrace podle celkového náboje
•(podobně možnost tepelné denaturace proteinů a následná ELFO)
•Dvousměrná (2-D) ELFO:
•připojení el. pole postupně ve dvou na sebe kolmých směrech
např.: 1. fáze = IEF, 2. fáze = SDS ELFO - kombinace pI a molekulové hmotnosti
•
•Schopnost separace proteinů krevní plazmy:
•CAGE: 5 pruhů; SGE: 15; PAGE: 19; IEF > 30;
2-D ELFO: ca. 300 skvrn ~ 75-100 polypeptidů
Elektroforéza
Metody ELFO

3_6
Detekce proteinů
•nespecifická: amidočerň, Coomassie Brilliant Blue R
•specifická:
barviva pro glykoproteiny, lipoproteiny
histochemické barvení enzymů: spřažení katalýzy přeměny specifického               substrátu s
barvicí reakcí              - nitrotetrazoliové soli (MTT, NBT) + PMS                 (phenazin
methosulfát); Fast Blue RR; Fast                Garnett GBC, Fast Black K
             - redukce NAD+, NADP+
             - někdy nutno dodat další enzymy
Elektroforéza

Elektroforéza
- obarvený gel = obecně elektroforetogram,
  jestliže obarveny enzymy = zymogram (enzymogram)
  proužky = „elektromorfy“, „alely“, „alelomorfy“
  izozymy, alozymy
3_8 3_9