Biologie kvasinek 23.9.2010 10-11.30hod Dr. Paleček Úvod – houby, význam, historie, kultivace 30.9.2010 10-11.30hod Dr. Paleček Metody studia, genetika a molekulární biologie kvasinek 7.10.2010 10-11.30hod Prof. Farkaš Buněčná stěna 14.10.2010 10-11.30hod Dr. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, HO endonukleasa, lokalizovaná exprese 21.10.2010 10-11.30hod Dr. Paleček Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy 28.10.2010 státní svátek 4.11.2010 10-11.30hod prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 11.11.2010 10-11.30hod prof. Svoboda Sekreční dráhy a endocytóza 18.11.2010 10-11.30hod prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 25.11.2010 8-12hod prof. Svoboda+Dr.Paleček - Cvičení k přednášce 2.12.2010 8-12hod prof. Svoboda+Dr.Paleček - Cvičení k přednášce 9.12.2010 10-11.30hod Dr. Paleček Organizace chromatinu a oprava DNA 16.12.2010 8-12hod Dr. Paleček Zkouška … trochu historie - savci pili alkoholický nektar miliony let (PNAS, 2008) - lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 roky (chleba před ~4000 lety) … - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy - dlouhodobá konzumace fermentovaných šťáv vedla k evoluční adaptaci tohoto savce – zvýšená exprese alkoholdehydrogenásy - autoři spekulují o vlivu takovýchto přírodních alkoholických nápojů na evoluci … nastavení hladiny ADH u člověka ;-) - - kvasinky Saccharomyces cerevisiae aj. rostou na substrátech bohatých na cukr - kvasinky fermentují sladký nektar z Bertramovy palmy A B C … trochu historie - savci pili alkoholický nektar miliony let (PNAS, 2008) - lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 roky (chleba před ~4000 lety) - poprvé kvasinky pozoroval A. van Leeuwenhoek v roce 1680 - název Zuckerpilz („cukerná houba“) tj. Saccharomyces od roku 1837 (T. Schwann) - L. Pasteur dokázal aktivní účast při kvašení (publikoval 1866, 1876) - první čisté kultury S. cerevisiae izolovány z piva (E.Ch.Hansen) a z vína (Muller-Thorgau) v 80.letech 19. století (cerevisiae = pivo v latině, pombe = pivo ve swahili) ... M. Rees popsal a pojmenoval S. ellipsoideus (fermentuje ovocné šťávy) -první systém pro klasifikaci (patogenních) kvasinek, založený na morfologii buněk a několika fyziologických testech (fermentace monosacharidů…) vytvořil A. Guilliermond v roce 1912 - v Československu prof. Kratochvilová … - - … nejintenzivněji studovaná eukaryotní buňka … - - první (S.c.) kompletně osekvenovaný eukaryontní genom v dubnu 1996 (S. pombe, 2002; v současnosti osekvenovaných >25 druhů kvasinek, + S.c. populační genomika => SNP polymorfismus) SGD databáze: http://www.yeastgenome.org/ SGD Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu (2001 – Nurse, Hartwell, Hunt) Science 272 (1996), p.481 + Nature 458, (2009), p337 Soubor:Ptilocercus lowii.jpg Přirozený výskyt - ve vodě (dle čistoty – moře 10/l, jezera 100/l, odpadní až 108/l; v arktických vodách Leucosporidium, v odpadních vodách Candida parapsilosis, S. exiguus, fekální znečištění indikuje Hansenula anomala, C. albicans, v olejem znečištěných vodách Candida (Yarrowia) lipolytica, C. tropicalis, v planktonu v závislosti na řasách např. Rhodotorula - v půdě (mnohem méně než bakterií, do 15cm hloubky – Schwanniomyces, Lipomyces, Cryptococcus, schopny hydrolyticky štěpit cellobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu) Conell et al., Microb Ecol 56 (2008) - naproti tomu v Antarktidě jsou dominantní - výzkum v letech 2003-4: Izolovány 2x asco- a 16x basidiomyceta (7x nové druhy) • Přirozený výskyt - na kazících se plodech (na spadlých plodech … schopny hydrolyticky štěpit cellobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu - zahnívající kaktusy => pektolytické bakterie => kvasinky Pichia cactophila, P. opuntiae => přenos a výživa drosofila) - na listech rostlin, květech (nektar palmy Bertramové … červené kvasinky rodu Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, černá Aureobasidium pullulans,) - přenášeny hmyzem (v zažívacím traktu mušek Drosophila z potravy, izolována Metschnikowia orientalis nalezena v květech a přenášena čmeláky na Cookových ostrovech, Int J Syst and Evol Microbiology, 2006) - img_levedura Kvasinky a savci - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy … i člověku se dostávají kvasinky do trávícího traktu např. při konzumaci burčáku ;-)) - kvasinky tvoří jen malou část stálé mikroflóry ve střevě - méně než 0,1 % mikroflóry •Kvasinky nalezeny ve střevě mouchy Drosophila •Askus chrání spory během průchodu trávicím traktem, ale zároveň dochází k částečnému natrávení enzymy, čímž se usnadňuje kontakt mezi nepříbuznými gametami •Bylo zjištěno, že průchod trávicím traktem 10x zvyšuje frekvenci sexuálního rozmnožování s nepříbuznými gametami •Hypotéza, že hmyz slouží jako vektor umožňující kvasinkám osidlovat nová prostředí, přičemž zvýšená rekombinace zvyšuje šance na přežití a adaptaci na ně - nejčastěji je z gastrointestinálního traktu izolována C. albicans - kůže, ústní dutina, sputum, vaginální sekrety, výtěry zvukovodů, moč, stolice ... -Saccharomyces boulardii – izolován z čínské švestičky Lyči - nepatogeni kolonizace střev (pouze dočasná) - používán jako probiotikum při střevních potížích (Enterol) - ochrana proti patogenům (Salmonella typhimurium) – modulují imunitní systém, inhibují účinky bakteriálních toxinů - -Immiflex – obsahuje beta 1-3,1-6 glukany z buněčných stěn kvasinek S.c. – aktivují imunitní systém (neutrofily) a zvyšují tak obranyschopnost organismu - -Pangamin – kvasinkové lyzáty – vitaminy, nenasycené mastné kyseliny, minerály … -15 druhů je potenciálními lidskými patogeny (vyvolávají onemocnění u oslabeného organismu – imunosupresiva, cukrovka …- antibiotika na eukaryota nezabírají) – více prof. Svoboda - -Kandidózy (C. albicans, dubliniensis, krusei, tropicalis, parapsilosis, glabrata, utilis, lipolytica) -Candida albicans – urogenitální a krevní infekce (vyskytuje se u člověka přirozeně) -Cryptococcus neoformans – 8% AIDS pacientů – plícní onemocnění až do mozku - (přenáší švábi a holubi – kreatinin z trusu používají jako zdroj dusíku) -Malassezia – poruchy pigmentace kůže a lupy tzv. pityriázy (M. furfur, globosa, japonica, obtusa, restricta, yamatoensis, dermatis, slooffiae, sympodialis,.nana, pachydermatis) -3 druhy Trichosporon (kúže) hongo_Malassezia_furfur Malassezia furfur tinea_01 pityriasis versicolor Tinea_Versicolor Význam -praktický - výroba piva, vína, etanolu a pekařského droždí (S.c.), různé kmeny pro spodní a svrchní kvašení, vinařské a lihovarské - krmná biomasa (Candida utilis), příprava mléčných výrobků (Candida kefyr, Klyuveromyces lactis), získávání ergosterolu (prekurzor vitaminu D), zdroj komplexu vitamínů skupiny B … - štěpení škrobu amylolytickými enzymy (Saccharmycopsis fibuligera, Schwanniomyces occidentalis) - štěpení dřevní hmoty – štěpí xylozu přímo na etanol za aerobních podmínek(Aureobasidium, Candida utilis, Pachysolen tannophilus, Candida shehatae a Pichia stipitis) - odbourávání ropných produktů (Yarrowia lipolytica) - -výzkumný - S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy - Rychle rostoucí eukaryontní buňka ... - Metody využívající kvasinek (2-H, FASAY) - Exprese proteinů (posttranslační modifikace, štěpení … hepatitis B core antigen, antithrombin proti srážení krve; Pichia pastoris) Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus •Sekvenace (hybridizace na čipech) > 100 kmenů z různých koutů světa •S. paradoxus – linie izolované podle lokalit • • • • • •S.cerevisiae - 3-4 původní linie, • které se díky člověku křížily … • Nature 458, (2009), p337 •Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny • •volná voda (nikoli chemicky vázanou) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) •aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem (potravinou) a tlaku par destilované vody • –0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií –0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) –0,75: většina halofilních mikroorganismů –0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) –0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry • •Bakterie vyžadují vyšší hodnoty aw (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) •Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa … lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) • •Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), •Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení • •Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %), na 10 % NaCl debaryomyces Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík •- Většina kvasinek je fakultativně anaerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) -fermentativní typy (S.c., S. p., rod Brettanomyces) - i v aerobních podmínkách fermentují (respirace i na glukoze představuje 10 % uhlíkového metabolismu) -respirativní typy (většina) – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací •- obligátorně aerobní – nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu - neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis • •- teploty, při nichž mohou kvasinky růst: • - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů • - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus, Candida) • - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) • •Maximální teploty, které některé kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C •Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), •teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny •Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol (Pichia pastoris), alkany apod.) •Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny • •Laboratorní podmínky: •YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa) •Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) •Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2SO4, 0,5g/l MgSO4 .7 H2O, 10g/l glukosa, 1ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar • Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) • C.tropicalis C.krusei Základní charakteristika kvasinek -Eukaryota – rostlinný systém – vyšší houby (1500 druhů) – rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) -Lineage› cellular organisms › Eukaryota › Fungi/Metazoa group říše › Fungi › Dikarya oddělení › Ascomycota › Saccharomycotina › Saccharomycetes řád › Saccharomycetales čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces - -Většinou jednobuněčné organismy (+ hyfy, + kolonie) -Nejčastěji kulaté a oválné (3-15 mikrometrů) -Množí se většinou pučením (+ jedině rod Schizosaccharomces: dělením - podlouhlé) -Zpracovávají zdroje uhlíku kvašením (vyjímky Lipomyces ...) Morfologie kvasinek -rotační elipsoid, kulaté, protáhlé – rod Dipodascus až 130 mikrometrů -3-15 mikrometrů (bakterie