~ 6000 heterozygotních delečních kmenů ~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů) (neesenciální – růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy) - Testováno ~400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...) - Celkem provedeno ~ 6milionů testů - multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potřebný pro resistenci vůči >20% z testovaných látek - Podobné profily svědčí o funkční podobnosti Science 320 (2008), p.362 Příprava mutant -V případě esenciálních genů je diploid transformován plasmidem s exprimovatelným wt genem – po jeho vypnutí se sleduje „terminální fenotyp“ -Pro sledování terminálního fenotypu jsou však lepší „kondicionální mutanty“ tj. teplotně (nebo chladově) sensitivní mutanty •Studium funkce genu – fenotyp delece či mutace •esenciální/nezbytný gen = smrt – plasmid nebo mutanty YFG 1 YF G 1 + G 1 Homologní rekombinace YF chromosom chromosom linearní DNA Transformace do kvasinkové buňky YFG1 = your favorite gene Příprava mutant tudium funkčních homologií – dvojité mutanty (synthetic lethal x epistatic) •Studium funkce genu – fenotyp delece či mutace •neesenciální – křížení tj. hledání funkčně příbuzných genů YFG 1 YF G 1 + G 1 Homologní rekombinace YF chromosom chromosom linearní DNA Transformace do kvasinkové buňky YFG1 = your favorite gene + - Křížením a následnou tetrádovou analýzou lze získat informace o vztazích mezi geny Životní cyklus S. cerevisiae - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida a tetrádovou analýzu 800px-Yeast_lifecycle - pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze provést i tzv. random sporulation) Tetrádová (genetická) analýza 800px-Yeast_lifecycle YPD Selektivní médium (SD-Trp ... testy) Segregace 2:2 A a A A A A a a A a A a … Esenciální gen Tetrádová (genetická) analýza 800px-Yeast_lifecycle Ab aB Ab aB Ab AB aB ab … ab AB AB ab … Synteticky letální Dvojité mutanty – funkční příbuznost Křížení haploidních kmenů (cílené na určité již známé geny/mutanty) a následá tetrádová analýza nebo mutageneze haploidního kmene pomocí hydroxylaminu (hledání příbuzného genu) … Po křížení může mít výsledný haploidní kmen buď stejný fenotyp (epistatic, bc) jako původní kmen nebo aditivní (neschopný růstu – synteticky letální, ab) E b C D a F E B A E b c D A F Hledání (screening) letálního mutanta – mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA) Epistatic Lethal D C F Protein complex Ab aB Ab aB Ab AB aB ab … ab AB AB ab … Supresory Supresory potlačují původní fenotyp – mutace téhož genu „napraví“ původní - mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou interakci - nadprodukce proteinu z paralelní dráhy - nadprodukce proteinu z téže dráhy A b C D E A b C D E F F A E D C F Protein complex F B E - mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban) - z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I) ... vztahy mezi nimi (synthetic lethality) a známými geny (multicopy suppressor) JCB 131 (1995) p.1529 ... P. Nurse Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) Plasmid shuffling Testování yfg1- mutant Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na ADE3 plasmidu, který je červený – po ztrátě ADE3 plasmidu jsou sektory kolonii bílé (mutace ade3 enzymu blokuje metabolickou dráhu před ade2 a nevzniká červený metabolit) Je ovšem lepší mutantu integrovat do chromosomu než testovat plasmidovou kopii Při studiu známého genu používáme cílené mutageneze (např. pomocí PCR) Buněčný cyklus S. pombe Nejprve rostou do délky na opačném pólu než se dělily septum S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) Buněčný cyklus S. cerevisiae -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (mitóźy) -oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 - -Oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze (S.pombe má rovnocenné dělení – velikost se kontroluje v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) -Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) -Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Curr Opin Gen Dev 5 (1995) Buněčný cyklus S. cerevisiae -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (mitóźy) -oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 - -Oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze (S.pombe má rovnocenné dělení – velikost se kontroluje v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) -Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) -Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Curr Opin Gen Dev 5 (1995) Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 - - Leland Hartwell začala studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. Podařilo se jí izolovat kvasinky, které měly mutovaný gen kontrolující buněčný cyklus. V následujících letech identifikovala podobným způsobem více než 100 genů kontrolujících buněčný cyklus. Také sledovala citlivost kvasinek na poškození DNA radiací. Zjistila, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu DNA Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe. V 70. letech objevil gen cdc2, který je zodpovědný za regulaci většiny fází BC. V roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou syntetizovány a odbourávány během určité části buněčného cyklu. Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu. Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují - diploidní buňky (při nedostatku N a C) zastavují v G1 a zahajují sporulaci - při vyčerpání živin z média přechází z G1 do stacionární fáze - nedostatek dusíku – růst pseudohyf - STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (arest pomocí alfa-faktoru, nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze) - v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy) - pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny A B CDC28 a cykliny u S. cerevisiae Interakce fosforylované Cdc28p s cyklinem (defosforylace) vzniká aktivní komplex: - v G1 fázi CLN1 a CLN2 (CLN3 mRNA je konstantní) - pro vstup do S fáze jsou nutné CLB5 a CLB6 (transkripce stimulovaná CLN) - zahájení mitózy se účastní CLB3 a CLB4 - mitózu ukončují CLB1 a CLB2 Trends in Genet 12 (1998) • sce04111 Párování S. cerevisiae 800px-Yeast_lifecycle - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci (za přítomnosti alfa-faktoru dochází k zastavení buněčného cyklu) - a-feromon se používá k synchronizaci buněk v G1 (elutriace pro buňky v G0, HU pro S fázi, nocodazol pro G2) Funkce jednotlivých proteinů v průběhu párování/matingu Ren et al., Science, 2000 Párování S. cerevisiae Diploid Fuze jader konjugace Chant, Curr Opin in Cell Biol, 1996 Signální dráha – a faktor Wang et al., Nature, 2004 Cdc28 Zastavení buněčného cyklu Morfologické změny (aktin) Aktivace transkripce Signální feromonová dráha Ste18p Ste4p Science 270 (1995) ste mutanty - sterile Ste2p • Ren et al., Science, 2000 ChIP on CHIP se Ste12p transkripčním faktorem