•Haploidní
•Diploidní
•Tetra- … polyploidní (pivovarské kmeny)

Saccharomyces cerevisiae
- haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (chrI=0.22 – chrXII=1.6Mbp)
- Krátké centromery a ARS (100bp)
- až 200 kopii rDNA v repetici (9kbp, chrXII), 262 tRNA, 40 snRNA,
- Geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní)
- Redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi
- <5% genů (220) obsahuje introny (0.5% genomu),
- 3% Ty1-5 transposony (46% u člověka)
- Kondenzovaný/tichý heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML
Základní prvky kvasinkového chromosomu

PFGE - princip
3
•PFGE gel obsahuje vzorky DNA uvnitř agarózových bločků (minimalizace náhodných zlomů velkých
molekul DNA)
•DNA prochází agarózou v závislosti na vloženém napětí
•při změně směru elektrického pole však větším molekulám DNA trvá déle, než se přeorientují
•
- contoured clamped homogeneous electric field (CHEF)
- hexagonální box – změna úhlu pole

Karyotypizace
•rozlišení druhů v rámci Saccharomyces
4

chrIII
Chromosom III (nejmenší)
CEN=centromera
ARS=autosomal replicating sequence
TEL=telomery
tRNA
Ty transposony
MAT a HML/HMR lokusy
Heterochromatin: centromera
telomery
HMR a HML
(MAT je aktivní
určuje haplotyp)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5213-5218.

Struktura kvasinkových telomer
Lowell et al., Cell Mol Life Sci (1998), p.32
300bp
Repetice ~5.5kbp
Telomery umlčují transkripci – ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně
transkribován
Cohen et al., Curr Genetics (1998), p.83
E. Blackburn, Nobelova cena, 2009

Struktura kvasinkových telomer
Lowell et al., Cell Mol Life Sci (1998), p.32
300bp
Repetice ~5.5kbp
Telomery umlčují transkripci – ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně
transkribován

YAC (yeast artificial chromosome)
»
• Studium kvasinkových elementů chromosomů definovalo nezbytné části a délku:
• CEN, ARS, TEL
•
• minimální délka 50kbp
• (až 500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp)
•
•
Lze analyzovat pomocí PFGE

rDNA - repetice
•rDNA kóduje geny pro ribosomální RNA
•Je vysoce konzervativní
•Identifikace a odlišování kvasinkových druhů
•Sledování evolučních trajektorii
•Až 200 kopii v řadě za sebou
•Problém s homologní rekombinací
•Problém s replikací – ve stejném směru jako
• transkripce (probíhá v S-fázi – kolize)

Centromera S. cerevisiae
Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005


Centromera S. pombe
- Pouze 3 chromozomy (13 Mbp = 3.5, 4.6, 5.7)
- kondenzované chromozomy - geny pro heterochromatin (S.c. nemá)
- velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace

Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006
Reinhardt a Bartel, Science, 2002
siRNA silencing

Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek
•Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné – barvení DNA na fixovaných preparátech
pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole)
•Použití centromerických proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium dynamiky chromatinu
•TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně definovaném lokusu
•ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo „ChIP on CHIP“
DAPI
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Pozadí = mtDNA

-zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace
-rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze
-jádro se protahuje – začátek M fáze (u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá)
-na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci
-
SPB-GFP barvení
Actin_2
DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae

Image courtesy of Jonathan Millar, Division of Yeast Genetics, National Institute for Medical
Research, London
Separace a segregace chromosomů
(centromera-kinetochora=Ndc80-GFP + SPB=Cdc11-CFP)

Model separace chromosomů
APC=anaphase promoting complex
Uhlmann et al., Nature, 1999
Cohesin komplex
(SMC=structure maintenance of chromosome)
SMC1, SMC3,
Scc1 a Scc3
Separasa-securin
TetR-GFP
TetO
Použití TEV proteasy

Kohesin „objímá” DNA
Hearing et al, 2002, Mol Cell
SMC1             Scc1/Rad21             SMC3             Scc3
Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid
SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (váží rapamycin)
Gruber et al., Cell, 2006

Vstup DNA přes opačný konec než uvolnění
Gruber et al., Cell, 2006
Uzamčení je pro buňku letální

Kohesin napomáhá při opravě dvou-řetězcových zlomů v G2/M fázi
Lowdens a Toh, Current Biology, 2005

>

Poškození DNA
•Studium kvasinek po ozáření … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51)
–Ionizující záření generuje především DSB (double-strand break)
–UV záření modifikuje nukleotidy tzv. TT-dimery
•Chemická činidla/mutageny modifikuji nukleotidy – mají za následek změnu genetické informace
–MMS (methyl methan sulfonat) – (např. MMS21)
–Alkylační činidla (např. EMS = ethyl methan sulfonat), ROS (reactive oxygen species)
•HU (hydroxy urea) blokuje replikaci – v mutantách dochází ke kolapsům replikační vidlice (např.
HUS1) => DSB
•
•
0721

Opravné mechanismy
•Dvoj-řetězcové zlomy (DSB)
–homologní rekombinace (HR) – v přítomnosti homologů (tj. sesterské chromatidy v G2 fázi)
–nehomologní spojování konců (NHEJ) – v G1 fázi
•Jednořetězcové zlomy, modifikace nukleotidů
–Přímé opravy (specifické enzymy)
–Vystřihování poškozeného úseku (BER, NER – excision repair)
•Opravy chybného párování
–MMR – mismatch repair (MSH1-6, MLH1-3)
–Speciální polymerázy (TLS – translesion synthesis)

Oprava DSB
•
Lisby a Rothstein, DNA repair, 2009

Závěry
•Kvasinky jsou využívány v biotechnologiích (pivo…)
•V klinické praxi mohou být nebezpečné pro pacienty se sníženou imunitou …
•Jako modelový organismus
•studium buněčných procesů
•Genetické, evoluční … analýzy