Olga
Böhmová
                              12.2.2010

Speciální imunologické metody – cvičení

Téma:                         Mikroskopování krevních nátěrů člověka

Teorie:            Bílé krvinky tvoří přibližně 1% z celkového objemu krve (přibližně 4-6l), jsou
trvalou součástí, přičemž jejich množství výrazně kolísá. Zjištění diferenciálního rozpočtu
leukocytů, což je přesného zastoupení jednotlivých typů leukocytů v krvi, je podstatné pro
stanovení diagnózy, neboť transformace  poměrů  může být příznakem infekčního onemocnění jako např.
AIDS.  V krvi člověka jsou nejhojněji zastoupeny neutrofily (tvoří min. 50% všech bílých krvinek),
dále lymfocyty (přibližně 30%). Eosinofily, basofily a monocyty se vyskytují v malém počtu a jejich
zvýšené množství svědčí o onemocnění.

                                800px-Hematopoiesis_simple.svg.png

          Obr. 1 Schéma diferenciace pluripotentní kmenové buňky a jednotlivé typy buněk


Druh leukocytů

                                                                                          Procentuální zastoupeni (%)

                                             Neutrofil

                                                                                                     57-67

                                             Eosinofil

                                                                                                      1-3

                                              Basofil

                                                                                                      0-1

                                             Lymfocyt

                                                                                                     24-40

                                              Monocyt

                                                                                                      3-8


                    Tab. 1 Procentuální zastoupení jednotlivých bílých krvinek:

Princip:           Diferenciál se stanovuje mikroskopicky v krevním nátěru. Při zhotovení krevního
nátěru naneseme kapku krve na jeden konec podložního skla. Druhým podložním sklem provedeme nátěr
dle obrázku. (obr. č. 1). Hotový nátěr po dokonalém zaschnutí barvíme podle Pappenheima. Obarvený
preparát po zaschnutí pozorujeme pod světelným mikroskopem.

                                              nater1

                            Obr. 2 Postup při zhotovení krevního nátěru

Materiál:        Kyvety na barvení, roztok May-Grunwald konc., PBS, Giemsa barvivo v poměru 1:9
s destilovanou vodou, metylalkohol, podložní skla, rukavice, sterilní bodece, ajatin na desinfekci,
alkohol na čištění skel, nastavitelné mikropipety, špičky, mikroskop.

Pracovní postup:
 1. Zhotovíme krevní nátěr
 2. Necháme zaschnout
 3. barvíme podle Pappenheima:

·         3 min fixace v kyvetě s methylalkoholem

·         3 min May-Grunwald konc.

·         1 min PBS

·         15 min Giemsa – Romanowski 1:9 s vodou

·         Opláchnout v PBS, nechat oschnout
 4. Necháme zaschnout
 5. Pozorujeme pod mikroskopem za použití imerzního objektivu při zvětšení 1000x.
 6. Počítáme 100 leukocytů pro určení diferenciálu. Jednotlivé typy leukocytů zaznamenáváme do
tabulky.


Výsledky:


H.K


M.M


O.B

P1010033

                                 Obr.3 Krevní nátěry naší skupiny


                                          Druh leukocytů

                                          Absolutní počet

                                      Procentuální zastoupení

                                            (elementy)

                                                (%)

                                            Neutrofily

                                                55

                                                55

                                         Neutrofilní tyčky

                                                 6

                                                 6

                                            Eosinofily

                                                 4

                                                 4

                                             Basofily

                                                 1

                                                 1

                                             Monocyty

                                                 3

                                                 3

                                             Lymfocyty

                                                31

                                                31


       Tab. 2 Počet jednotlivých elementů v krevním nátěru a jejich procentuální zastoupení

Závěr:                        Díky této úloze jsem se naučila rozeznávat jednotlivé typy leukocytů
a stanovení diferenciálu. Procentuální zastoupení je v mém nátěru bylo v normě, vyjma nepatrně
zvýšeného (o 1%) počtu eosinofilů.