Olga Böhmová 12.2.2010 Speciální imunologické metody – cvičení Téma: Příprava roztěru hemolymfy Teorie: Pozorování buněk hemocytů, hemolymfa u bezobratlých Cíl: připravit roztěr z jednoho zástupce hmyzu (zavíječ voskový nebo bourec morušový) ke sledování hemocytů u hmyzu. Materiál: larvy bource nebo zavíječe, kyvety na barvení, roztok May - Grünwald konc., PBS, Giemsa barvivo v poměru 1:9 s destilovanou vodou, metylalkohol, podložní skla, rukavice, sterilní bodce, ajatin na desinfekci, alkohol na čištění skel, budík, nastavitelné mikropipety, špičky, žiletky, teplotní vodní lázeň Postup práce: Ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme Roztěr: blod-smear3 Roztěry pushed_fims 1. příliš tenký a dlouhý 2. dobrý 3. příliš krátký, kapka krve byla moc malá 4. příliš silný, kapka krve byla moc velká Převzato z http://www.aum.iawf.unibe.ch/hemosurf/Demo_E/Lab/smears_quality.htm Barvení podle Pappenheima v kyvetách: 3 min. fixace v kyvetě s metylalkoholem 3 min. May - Grunwald konc. (minimálně 2 min.) 1 min. PBS 15 min. Giemsa - Romanowski 1:9 s vodou opláchnout v PBS, nechat schnout pozn. sklíčka vkládat rubem k sobě do 1 drážky Vyhodnocení: v roztěru z hemolymfy pozorujeme hemocyty, z krevních roztěrů člověka i myši počítáme krevní diferenciál - viz návod na další praktika Sledování fagocytárních schopností hemocytů u larev Bource morušového nebo Zavíječe voskového. Teorie: V hemolymfě se nachází tyto typy hemocytů: prohemocyt, plazmatocyt, granulocyt, eonocytoid, coagulocyt, sferulocyt, adipohemocyt. U Zavíječe fagocytují plazmatocyt a granulocyt, u Bource jen granulocyt. Cílem bude naučit se poznávat hemocyty a pozorovat jejich fagocytární aktivitu. Cíl: Sledování fagocytární aktivity hemocytů, výpočet fagocytárního indexu a % fagocytózy Materiál: Larvy Bource nebo Zavíječe (na každého posluchače 1 kus), roztok suspenze inertních částic MSHP (600 000/1 ml, PBS:MSHP – 1:1), fenylthiomočovina, injekční stříkačka - mikrotubulinka, nůžky, podložní sklíčka, barvící roztoky, eppendorfky, špičky, nastavitelné mikropipety Postup: 1.Ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme 2.další kapku - 20 μl přeneseme do eppendorfky obsahující fenylthiomočovinu, aby se hemolymfa nesrazila, přidáme 15 μl roztoku částic MSHP a necháme kultivovat 30 minut 3.po kultivaci kápneme kapku hemolymfy stejným způsobem na podložní sklíčko a rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme 4.do další larvy injikujeme 15 μl roztoku inertních částic, larvy necháme v teple 30 min kultivovat 5.po kultivaci částic MSHP v larvě ustřihneme 1 nožku larvy a vytékající hemolymfu zachytíme kapkou na sklíčko a kapku rozetřeme a sklíčko s nátěrem zahřejeme 6.roztěry barvíme podle Pappenheima. (viz výše) Výsledek a vyhodnocení: Pozorujeme a počítáme poměr množství fagocytovaných částic a množství fagocytů a vypočítáme fagocytární index (FI) a % fagocytózy zvlášť u fagocytózy s částicemi MSHP a zvlášť u fagocytózy s bakteriemi. FI = (počet fagocytovaných částic)/(počet fagocytujících buněk) % fagocytózy = (počet fagocytujících buněk)/(celkový počet buněk schopných fagocytózy v daném prostoru) x 100 1. Roztěry hodnotíme pomocí diferenciálního počtu hemocytů, při kterém jako fagocytující označujeme jen ty částice, které pohltily 3 a více partikulí. 2. Vypočítáme fagocytární index FI tak, že dělíme počet fagocytovaných částic počtem fagocytujících buněk. 3. Vypočítáme % fagocytózy tak, že dělíme počet fagocytujících buněk v daném prostoru počtem všech buněk schopných fagocytózy a násobíme 100. Příklad vyhodnocení: plasmatocyt granulocyt neznámý suma 3 3 4 1 5 3 3 4 4 4 1 5 3 3 21 2 (%) 0 (%) 23 Tabulka: počty fagocytujících hemocytů v roztěru hemolymfy hmyzu FI = počet fagocytovaných částic / počet fagocytujících buněk = X %F = počet fagocytujících buněk / počet buněk schopných fagocytózy = X% Schéma pokusu METODA Bez fagocyt. (kontr.) Fagocytóza in vivo, in vitro každý ze dvojice larva sklo kapka → → roztěr, barvení 20 μl hemol + 15 μl (MSHP ) → → kultivace → → roztěr , barvení larva + 15 μl (MSHP + hep.) → → kultivace → → roztěr , barvení Výsledky: V praktiku jsem se naučila v roztěru hemolymfy rozeznávat základní typy buněk – hemocytů. Především plazmatocyty, sferulocyty, granulocyty, ojediněle i prohaemocyt a adipocyt. Cystocyt se mi v roztěru nepodařilo nalézt. Na následujících obrázcích jsou hemocyty z roztěru hemolymfy při tisícinásobném zvětšení za použití imersního objektivu. Obr. 1 granulocyt (kontrola) 1000x zvětšeno Obr. 2 plasmatocyt (in vitro) 1000x zvětšeno Obr.3 plasmatocyt (in vivo) Součástí tohoto úkolu bylo i sledování fagocytárních schopností hemocytů u larev zavíjěče voskového IN VIVO IN VITRO plasmatocyt granulocyt plasmatocyt granulocyt 0 3 4 3 1 0 5 0 0 0 3 5 0 3 5 2 5 7 3 2 6 1 5 6 1 3 6 1 1 15 4 4 2 1 4 2 3 4 0 3 14 35 39 21 Výpočet fagocytárního indexu FI[IN VITRO] = (počet fagocytovaných částic)/(počet fagocytujících buněk) FI[IN VITRO] = 60/20= 3,0 FI[IN VIVO] = 49/20= 2,5 Výpočet procenta fagocytózy % fagocytózy = (počet fagocytujících buněk)/(celkový počet buněk schopných fagocytózy v daném prostoru) % fagocytózy[IN][ VITRO] =14 /20=0,7 In vitro fagocytuje 70% fagocytů % fagocytózy[IN][ VIVO] = 9/20= 0,45 In vivo fagocytuje 45% fagocytů Závěr: Fagocytární index je vyšší in vitro než in vivo. To znamená, že in vitro připadá v průměru na jeden fagocyt 3 pohlcených částic. In vivo je v průměru fagocytováno 2,5 částic MSHP jedním fagocytem. Z toho vyplývá, že buňky in vitro snadněji pohlcují cizorodé částice. To potvrzuje i vypočtené procento fagocytózy, které je při in vitro pozorování 1,2x větší než pozorování in vivo. Toto procento fagocytózy udává, kolik procent z fagocytů daného pozorovaného souboru fagocytovala cizorodé částice MSHP.