ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Podzim 2010 1. Úvod do teorie PCR Petr Vaňhara Literatura http://www.gene-quantification.info/ • Bustin SA: A-Z of quantitative PCR. IUL Biotechnology Series, Vol. 5, La Jolla, California, 2004-2006 • Dorak T: Real Time PCR. BIOS Advanced Methods, Taylor• Dorak T: Real Time PCR. BIOS Advanced Methods, Taylor & Francis Group, NY, 2007 • Stephenson FH. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory. Academic Press 2003. • Pfaffl MW. Methods (in Enzymology), The ongoing Evolution of qPCR. 50(4), 2010 1952 Elektroforéza 1967 • Rekombinantní DNA • Objev DNA ligázy 1969 FISH 1970 • Restrikční endonukleázy • Reverzní transkriptáza 1972 Klonování 1973 In vitro konstrukce Molekulární technologie 1984 Pulzní gelová elektroforéza 1985 • PCR • DNA fingertyping 1987 • YACs • Místně cílená mutageneze 1988 Taq Polymeráza ChIP 1990 BLAST 1992 BACs 1995 Microarrays 1973 In vitro konstrukce bakteriálního plazmidu 1975 Southern blot 1977 Sekvenování DNA 1980 Koncept RFLP 1981 Western blotting 1982 • Manipulace s genomem Drosophily – P elementy • Whole genome shotgun 1998 RNAi 2002 UCSC Genome Browser 2003 DNA assembly programs 2004 Anotace genů – ENSEMBL 2005 • Projekt HapMap • Ligační sekvenování 2006 Celogenomové metylační mapy 2007 miRNA 2009 Next Generation Sequencing What about DNA? • Maurice Wilkins-James Watson-Francis Crick-Rosalin Franklin, 1953 • Nobelova cena Wilkins-Watson-Crick,1962 • model dsDNA King’s College London Southern blot, RFLP, … Northern/Western blot, Flowcytometrie, … Kultivace, biochemické analýzy Molekulární technologie 1. zjistíte, zda pacient nese nějakou, klinicky významnou, bodovou mutaci, která např. určuje jeho další léčbu? 2. zjistíte, který ze dvou genů je v nějaké tkáni (např. nádorové) exprimován více než druhý ? 3. stanovíte druh patogenní bakterie ve vzorcích z nemocného pacienta? Jakým způsobem bez použití PCR: PCR Cytogenetické vyšetření z nemocného pacienta? 4. zastoupení leukemických buněk v krvi pacienta před a po léčbě? Studies on polynucleotides XCVL. Repair Replication of Short Sythetic DNA's as catalysed by DNA polymerases. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana H. G. (1971): J.Mol.Biol.56,341-361. Koncept cyklické reparativní replikace 1971 Denaturace DNA polymeráza Nová DNA polymeráza Renaturace Kjell Kleppe Har Gobind Khorana Renaturace ReplikaceReplikace Denaturace Extrémně nákladná syntéza oligonukleotidů, nedokonalé sekvenování, termolabilita a nákladná purifikace DNA polymeráz, nedostupná instrumentace... Nová DNA polymeráza Har Gobind Khorana Práce popsala některé parametry reparativní replikace – účinnost replikace, minimální délky primerů a templátu, sekundární struktury atd. ... ... Proč se nerozšířila tato metoda už v 70.letech? První možnost diagnostické replikace DNA 1985 Two new methods were used to establish a rapid and highly sensitive prenatal diagnostic test for sickle cell anemia. The first involves the primer-mediated enzymatic Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. amplification of specific beta-globin target sequences in genomic DNA, resulting in the exponential increase (220,000 times) of target DNA copies. In the second technique, the presence of the beta A and beta S alleles is determined by restriction endonuclease digestion of an end-labeled oligonucleotide probe hybridized in solution to the amplified beta-globin sequences. The beta-globin genotype can be determined in less than 1 day on samples containing significantly less than 1 microgram of genomic DNA. . Kary B. Mullis Praktická aplikace PCR 1987-8 • Použití termostabilní DNA polymerázy Nobelova cena za chemii 1993 • Použití termostabilní DNA polymerázy • Rozvedení konceptu navrženého K. Kleppem • Obrovský boom PCR díky technologickému pokroku •363 629 článků k 27.11.2008 •399 022 k 1.12.2009 PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA PCR Exponenciální proces Amplikon, templát Amplifikace (y) = N × 2n N= počet molekul templátu, n počet cyklů PCR Otázka: 1.Jedna molekula DNA je amplifikována v 25 cyklech. Teoreticky, kolik molekul amplikonu (y) je vytvořeno? 2.Počáteční množství molekul templátu je N=600. Kolik molekul amplikonu je vytvořeno? 3.Reakce je provedena v 100µl. Kolik molekul amplikonu bude přítomno v 1 nl (0,001 µl)? 1. 225= 33 554 432 2. 600 × 225= 2 × 1010 3. 2 × 1010 ve 100 µl → v 0,001 µµµµl bude 2 ×××× 105 (200 000) molekul amplikonu Odpověď: KONTAMINACE JE PROBLÉM Jediná molekula DNA může způsobit velké problémy (forenzní genetika, rutinní screening a diagnostika, GMO…) Otázka: 2 ng lidké genomové DNA byly použity jako templát pro PCR. Výsledkem je 100 ng DNA o délce 242bp. Jaká je míra amplifikace? PCR Odpověď: 1. Určení počtu kopií obsažených v daném množství DNA (2 ng genomové DNA; předpokládáme haploidní genom) N haploidní genom 3 × 109 průměrná MW báze: 660 g/mol → m = N Na Mw m [g] = 3 109 660 6,023 1023 m [pg] = 3,3 pgmnožství DNA obsahující jednu kopii: počet kopií ve 2ng DNA: cca 600 (606) 2. Určení hmotnosti 242bp. fragmentu m [pg] = 242× 660 6,023 1023 1 1012 m [pg] = počet kopií ve 100ng amplifikované DNA: × 2,7 × 10-7 pg hmotnost (m) 242bp fragmentu: PCR počet kopií ve 100ng amplifikované DNA: 100 ng × 103 2,7 × 10-7 pg n = m [pg] = 3,7 × 1011 kopií 3. Určení míry amplifikace 600 y = 3,7 × 1011 = 6,2 × 108 Bylo dosaženo 6,2 × 108 nárůstu množství amplikonu Plateau fáze Exponenciální fáze Kinetika PCR reakce y=N 2n Exponenciální fáze y=N (1+E)n Kvantifikace pomocí PCR Konvenční vs. Real-Time PCR Konvenční kvantitativní PCR -„End point“ stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu Kvantifikace pomocí PCR „End point“ obrovský vliv na množství amplikonu • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) • Syntetický standard • Kompetetivní PCR • Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduální choroby u onkologických pacientů Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Zásadní omezení – gelová elektroforéza • Nízká přesnost • Nízká citlivost • Malý dynamický rozsah – pouze 2log. • Nízké rozlišení, založené pouze na délce amplikonu • Není automatizovaná • Výstup není numerický – subjektivní hodnocení • EtBr – neváže se na DNA pravidelně • Post PCR zpracování - kontaminace Průtoková cytometrie Alternativy detekce amplikonu „End-point“ DNA Denaturace a hybridizace se specifickou sondou PCR Intenzita chemiluminiscenčního signálu v závislosti na množství amplifikované DNA Chemiluminiscence Alternativy detekce amplikonu „End-point“ Biotinylovaný amplikonPCR Streptavidin + magnetické částice Separace chemiluminiscence Biotinylované primery • Chemiluminiscence Fluorescence correlation spectroscopy Alternativy detekce amplikonu „End-point“ Real-time Fluorescence Based PCR Kvantitativní vztah mezi Množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • Amplifikační práh detekce (Ct) Real – time detekce amplifikace „end point“ Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí Exponenciální fáze „end point“ „real-time“ Real-time Fluorescence Based PCR Real – time detekce amplifikace Fluorescence R je zajištěna např. vazbou fluorescenčního interkalačního barviva na DNA, použitím hydrolyzační sondy atd. Fluorescence reportérového fluoroforu je normalizována vůči pasivnímu fluoroforu (Rox) - Rn. Změnu fluorescence v čase vůči pozadí udává ∆Rn. (∆Rn=Rn+- Rn-). Reportérový fluorofor Real – time detekce amplifikace Pasivní fluorofor Intenzita jeho fluorescence závisí na amplifikaci templátu během PCR Pasivní fluorofor Intenzita jeho fluorescence je během PCR konstantní Zahrnutí fluorescence pasivního fluoroforu do výpočtu technicky zpřesňuje analýzu Treshold cycle „Ct“ („Cq“) – určený na základě hodnoty fluorescence pozadí (backround) a aktuální fluorescence vzorku – kvantitativní výstup pro každý vzorek Real – time detekce amplifikace - Ct Treshold Fluorescence Treshold cyclesBackground Treshold cycle „Ct“ - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct tím větší počet kopií templátu na začátku reakce Real – time detekce amplifikace - Ct A CB A CB> > - rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n = 10 Treshold cycle „Ct“ Real – time detekce amplifikace - Ct n=log10/log2 = 3,32 50 100 150 250300 0 c [ng/µl] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 Přestávka (Kofein) Faktory ovlivňující qPCR Koncentrace MgII+ (MnII+) - Kritický faktor pro DNA polymerázy - Např. Tth (Thermus thermophilus HB-8) MnII+ (3-6mM) Taq (Thermus aquaticus) MgII+ (3-4mM) - Některé polymerázy preferují určitou formu MgII+, mimo MgCl2 např. MgSO4 nebo Mg(OAc)2 Faktory ovlivňující qPCR Koncentrace primerůKoncentrace primerů - obvykle 100-900nM - ne vždy poskytuje ekvimolární koncentrace nejlepší výsledek Koncentrace sondy - obvykle 100-400nM - volba sondy podle typu analýzy a žádaného výstupu (genová exprese, SNP, absolutní kvantifikace…) Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy - Fidelity, maximální amplifikovatélná délka amplikonu – Vyžadují 3’OH primer – Teplotní stabilita - nejvyšší katalytická účinnost mezi 70-80°C – Výrazná ztráta aktivity při nižších teplotách • např. Taq při 37°C má pouze 10% své normální aktivity - Fidelity, maximální amplifikovatélná délka amplikonu - bakteriální Taq Thermus aquaticus - nízká fidelity - absence 3' > 5' exonukleázové aktivity (proofreading) - Archeální enzymy - Thermococcus sp. (T. gorgonarius, litolaris, kodakaraensis) • Tgo, Vent, Pfx - Pyrococcus sp. (P. furiosus) • Pfu, Deep Vent http://www.biologie.uni-regensburg.de/Mikrobio/Thomm/Buttons/bilder/thermococcus-ch-Pt.jpg Jméno 3’>5’ Exoaktivita Zdroj Poznámka Taq - Thermus aquaticus Poločas rozpadu v 95°C - 1,6 hod. Pfu + Pyrococcus furiosus Nejmenší error-rate Vent (Tli) + Thermococcus litoralis Poločas rozpadu v 95°C - 7 hod. Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy a PCR – Zajištění 3' > 5' exonukleázové aktivity zvyšuje specifitu reakce – Některé aplikace (TaqMan) vyžadují 5' > 3' exonukleázovou aktivitu polymerázy (odbourání sondy, in vivo RNA primerů při syntéze Okazakiho fragmentů), jiné aplikace (molekulární majáky, scorpions) naopak vyžadují polymerázy bez nukleázové aktivity Genová exprese, RT-PCR RT PCR Reverse Transcription PCR - dvě na sebe navazující enzymatické reakce PCRReverzní transkripce http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32 http://www.obgynacademy.com/basicsciences/fetology/genetics/images/pcr.png - mnohonásobně citlivější než např. northern/dot blot, RNAse /S1 protection assays, nebo ISH - exprese mRNA, detekce a kvantifikace virů atd. Kvantitativní RT PCR RNA Reverzní transkripce cDNA RNA Reverzní „one step“ RT-PCR„two step“ RT-PCR cDNA PCR Reverzní transkripce cDNA & PCR „Cells to Ct“ approach Kvantitativní RT PCR One step or two step PCR? One or two step PCR One tube/two enzymes Two tubes/two enzymes Feature Advantages Disadvantages Feature Advantages Disadvantages Reduced hands- Fewer errors Dedicated Separate More pipettingReduced handson time Fewer errors More rapid Higher throughput Dedicated enzymes Separate optimisation enhanced sensitivity More pipetting errors Less pipetitng Fewer errors Multiple priming options Separate cDNA pool Multiple targets Reagents added at start Less contamination No separate optimization cDNA synthesis Safer long term storage Higher temperature Higher specifity Target specific priming only Reverzní transkripce RT - templát polyribonukleotidy i polydeoxyribonukleotidy - syntéza DNA na základě RNA templátu - tzv. RDDP nebo DDDP aktivita (RNA/DNA directed DNA polymerase) - replikace retrovirů (HIV) Průběh RT 1. RDDP syntéza DNA řetězce podle RNA templátu 2. odbourání RNA, RNAse H 3. DDDP syntéza druhého DNA řetězce Reverzní transkripce RT Primery - endogenní náhodný priming – nežádoucí variabilita v PCR - náhodné primery (hexamery, oktamery, dekamery) - převažující frakce cDNA – rRNA, problematická determinace low copy targets - nadhodnocuje množství mRNA vůči specifickým primerům - oligo dT TTTTTTTTTTTTTTTTTTT- oligo dT - poly A mRNA - histony nebo virové geny postrádají poly A - nutná RNA o vysoké kvalitě (nefragmentovaná) - „anchored oligo dT“ - specifické primery - nejvhodnější pro kvantifikaci - separátní reakce pro jednotlivé stanovované sekvence TTTTTTTTTTTTTTTTTTT NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAA NTTTTTTTTTTTTTTTTTTT NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAA Reverzní transkripce RT Reverzní transkriptáza • vysoké procento chyb (nemají proofreading) • citlivost k sekundárním strukturám - způsobí terminaci polymerace nebo vynechání úseku sekundární struktury • vysoká procesivita v případě malých amplikonů - krátké molekuly cDNA • optimální reakční teplota 50-55°C• optimální reakční teplota 50-55°C • dvojmocné ionty, MnII+, MgII+ - fidelity Aditiva • optimalizace účinnosti RT • mechanismus nejasný, pravděpodobně ovlivňují termostabilitu enzymu nebo tvorbu sekundárních struktur templátu • různé výsledky s různými enzymy a reakčními podmínkami Reverzní transkripce RT Trehalóza Betain (trimethylglycerin)Trehalóza 0,6M/15% glycerol - brání tepelné inaktivaci enzymu Zvyšuje enzymatickou aktivitu MMLV-RT při 60°C Úspěšná syntéza řetězců o délce 10kb Zvýšení specifity odT primerů (Superscript II) Betain (trimethylglycerin) Osmoprotektant Stabilizace AT párů Snížení termostability GC párů – snížení Tm Kombinace 2M betainu a 0,6M trehalózy Závislost na templázu a amplikonu Optimalizace Reverzní transkripce RNáza H degradace duplexu cDNA/RNA Kompetuje se syntetickou aktivitou RT (Degradace duplexu DNA primer/RNA proběhne s větší pravděpodobností než extenze řetězce) = snížený výtěžek cDNA Ale: – neodbouraná RNA může omezovat hybridizaci primerů a snižuje citlivost PCR RNáza H – neodbouraná RNA může omezovat hybridizaci primerů a snižuje citlivost PCR – PCR primery mohou být zbytkovou RNA vyvázány - tvrdé denaturační podmínky (97°C) http://www.ambion.com/techlib/tn/101/1.html Reverzní transkripce AMV RT AMV (Avian myeloblastosis virus) RT • Syntéza DNA z DNA nebo RNA templátu • DNA primery, oktamery a delší jsou efektivnější než hexamery • Nekompetetivně inhibovaná tRNA • Optimální reakční teplota 42°C • Modulární enzym • Thermoscript (Invitrogen) – vyšší teplotní stabilita (65°C), redu kovaná aktivita RNázy H (tvorba cDNA knihoven) • Četnost chyb 4,9 × 10-4 Perbal B., Retrovirology 2008, 5:49 MMLV (Moloney murine leukemia virus) RT • Nižší aktivita RNázy H než v případě AMV-RT • Termolabilní, optimum 37°C • DNA i RNA primery, DNA primery 9-15bp vhodnější • Modulární enzym • Modifikované MMLV RT (redukce aktivity Rnázy H, termostabilita) Reverzní transkripce MMLV RT • Modifikované MMLV RT (redukce aktivity Rnázy H, termostabilita) – Superscript II (Invitrogen), Powerscript (Clontech) • MgII+ - syntéza dlouhých cDNA • MessageSensor (Ambion) – One step PCR, pro kvantifikace už od 500 fg RNA - RNAse H + Reverzní transkripce DNA pol RT DNA polymerázy s RT aktivitou Tth (Thermus thermophilus), Tfl (T. flavus), BcaBEST (Bacillus caldotenax) -Takara RDDP i DDDP aktivita Vyšší termostabilita než RT Vysoká četnost chyb (nemají 3’ - 5’ exonukleázovou aktivitu)Vysoká četnost chyb (nemají 3’ - 5’ exonukleázovou aktivitu) C. therm polymerase (Roche) Klenowův fragment z Carboxydothermus hydrogenoformus Vysoká teplotní stabilita a přesnost syntézy (četnost chyb poloviční ve srovnání s Tth) Reverzní transkripce Ostatní RT Omniscript, Sensiscript RT (Qiagen) Nejsou odvozeny od AMV RT nebo MMLV RT Obtížně transkribovatelné templáty http://www1.qiagen.com/Products/Pcr/QiagenReverseTranscriptases/OmniScriptRT.aspx?ShowInfo=1 Sensiscript RT Kontaminace v PCR Kontaminace Cross contamination Carry-over contamination PCR 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Vzájemná kontaminace vzorků PCR 2 PCR 2PCR 1 Přenos amplikonu do dalších PCR Jak předejít kontaminaci Kontaminace • Správná laboratorní praxe • Plastik v „RNA/PCR“ kvalitě • Automatizace ×× www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006 HotStart Taq Hot Start • Modifikace polymerázy (Chemická modifikace, MoAb) • Upravená, teplotně senzitivní polymeráza www.qiagen.com HotStart dNTPs Hot Start • Modifikace termolabilní tetrahydrofuranovou (THF) skupinou (cyklický ether) • Brání extenzi a dimerizaci primerů • Zvýšením teploty dojde k uvolnění THF a vzniku standardních dNTPs • Fyzické oddělení jednotlivých reakčních složek • Vyvázání nebo chemická modifikace primerů Alternativní HotStart přístupy Hot Start Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG • odstraňuje uracil z DNA • zahajuje bazovou excizní reparaci – dochází k odštěpení poškozené báze (deaminovaný cytosin) a vzniku AP místa (apurinové, apyrimidinové místo) • Pokud reakční PCR směs obsahuje dUTP místo dTTP, výsledný amplikon bude obsahovat „U“ místo „T“ • UNG rozpozná místa v DNA,která obsahují „U“ a štěpí je za vzniku AP místa • DNA obsahující AP místa je termolabilní • Lze tak zabránit „carry over“ kontaminaci – PCR produkt nemůže být reamplifikovaný Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG • Použitím UNG a vhodné směsi dNTP, lze zabránit „carry over“ kontaminacím v laboratoři – PCR produkt nemůže být reamplifikovaný • Vlastnosti DNA obsahující „U“ místo „T“: - dU mají stejnou schopnost hybridizace jako dT - lze ji použít i pro dideoxy-NTP sekvenování - PCR fragment lze přímo klonovat do UNG- kmenů www.appliedbiosystems.com; www.invitrogen.com Shrnutí Konec Po dnešní přednášce: • umíte si popsat kinetiku PCR • znáte rozdíl mezi end-point a real-time PCR • víte, co to je R, Rn, ∆Rn, Ct • znáte vztah mezi Ct a množstvím amplikonu • umíte popsat a rozhodnout se, kdy použít One Step a Two Step PCR• umíte popsat a rozhodnout se, kdy použít One Step a Two Step PCR • víte, co to jsou DNA polymerázy a reverzní transkriptázy, znáte jejich charakteristiku i průběh reverzní transkripce • víte, co to znamená HotStart PCR a UNG a jak předejít případným kontaminacím ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR 2. Kvantifikační strategie Repeatability (Opakovatelnost) Intra-assay variabilita (stejná analýza v jedné laboratoři) Reproducibilty (Reproducibilta) Inter-assay variabilita (stejná analýza v různých laboratořích) Kvantifikační strategie Přesná kvantifikace závisí na: Precision (Přesnost) Shoda mezi experimenty („jak přesně pipetujeme“) Accuracy (Správnost) Shoda mezi experimentálně zjištěnou hodnotou a realitou Kvantifikační strategie Faktory ovlivňující PCR Templát – Izolace RNA - Volba zdroje (charakter tkáně, biopsie, mikrodisekce…) - Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA - Čistota (A266/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů - Přesné určení koncentrace RNA - Celková RNA nebo mRNA?- Celková RNA nebo mRNA? - Vhodnost metody, automatizace, výtěžek… Templát – Izolace RNA Kvantifikační strategie Reverzní transkripce - Významný zdroj variability v qRT-PCR - Metoda izolace RNA může významně ovlivnit proces reverzní transkripce - Volba primerů, enzymu, teplotního profilu - One step vs. Two step PCR Kvantifikační strategie - Výtěžek cDNA - sekvence směrem 5’konci signifikantně nižší výtěžek než 3’ - RNáza H Kvantifikační strategie End-point vs. Real-Time PCR – Vztah mezi vstupním množstvím templátu a výsledným množstvím amplikonu je úměrný pouze v exponenciální fázi rakce. – Klasická PCR proto musí být zastavena ještě před dosažením plateau fáze. – Intra-assay variabilita klasické PCR (30-40%); Inter-assay variabilita (50-70%) end point Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí - background Exponenciální lieární fáze end point real-time Kvantifikační strategie Zpracování dat A data přímo z přístroje B vyhlazení dat C normalizace pozadí (na základě nespecifické fluorescence) D normalizace amplitudy signálu (na základě plateau) Množství polymerázy stanovení Ct Koncentrace primerů Tvar mikrozkumavek 100% Kvantifikační strategie Účinnost PCR (Efficiency) Y=N 2n Y=N (1+E%)n Účinnost PCR je 100% jen výjimečně, dokonce i v případě opakovaných PCR identických templátů Účinnost PCR Kvantifikační strategie Externí standardy Kvantifikační strategie NC = N0´(E + 1)C N0 = NC/(E + 1)C N0 = Nt/(E + 1)Ct Směrnice (k) = -Log(E + 1)Směrnice (k) = -Log(E + 1) E = 10-1/k Posun = Log(Nt) Nt = 10posun Platné za předpokladu: E je konstantní během celé PCR E standardů a vzorků je shodná GAPDH Gen 3 Gen 1 Gen 2 Výpočet účinnosti PCR – externí standardy Kvantifikační strategie k E % Gen 1 -3,3848 1,9744 97,44 Gen 2 -3,8847 1,8089 80,89 Gen 3 -3,560 1,9094 90,94 Reference gene (GAPDH) -3,4594 1,9475 94,75 Ideálně -3,32 2 100 R2 ≥ 0,98 Kvantifikační strategie Výpočet účinnosti PCR 1. E = 10-1/k - obvykle od E = 1,60 – 2,10 při R2 > 0,989 - pg – desítky ng cDNA - vztah mezi Ct a log množství cDNA – lineární – min. 5 řádů - nadhodnocování reálné účinnosti PCR 2. Výpočet z nárůstu fluorescence v lineární fázi - E = 1,35 – 1,65- E = 1,35 – 1,65 - podhodnocování reálné účinnosti (datové body z oblasti blízké plateau) 3. Výpočet na základě všech datových bodů (Sigmoidal curve fitting method, SCF) - Není nutné odečítání hodnot pozadí - E = 1,35 – 1,65 4. Výpočet na základě nárůstu fluorescence v exponenciální fázi - Yn = Y0(E)n Účinnost PCR Kvantifikační strategie Otázka: Provádíte PCR alikvotu templátové DNA obsahujícího 3×105 kopií. V předchozích experimentech jste určili efektivitu reakce 85%. Kolik cyklů musíte provést, abyste dosáhli výsledného počtu kopií 2 ×1010 ? n Odpověď: Y= N(1+E)n Y = 2 ×1010 2 ×1010 = 3×105 (1+0,85) 2 ×1010 3 ×105 =log log (1+0,85)n × K amplifikaci z 3××××105 na 2 ××××1010 s účinností 85% je nutných 18 cyklů. Y = 2 ×1010 N = 3×105 E = 0,85 n = ? 3 ×105 =log log (1+0,85)n × 2 ×1010 3 ×105 =log log (1+0,85) n = 0,67 ×104log n × log 1,85 n = 17,8 Absolutní kvantifikace Relativní kvantifikace Kvantifikační strategie 1. Absolutní kvantifikace • srovnání Ct jednotlivých vzorků s externím standardem (kalibrační křivkou) • Exaktní výsledek – zvolená jednotka (např. počet kopií/ng RNA/ml krve/ genom/buňku/hmotnost tkáně… atd.) • Vysoká reprodukovatelnost, specifita a přesnost kalibračních křivek • Velký dynamický rozsah – 101-1010 molekul templátu Kvantifikační strategie • Validace • Volba externího standardu (recDNA, gDNA, RT-PCR produkt, recRNA, syntetické oligonukleotidy…) • Reprodukovatelnost výsledků Externí standardy DNA − Plazmidová DNA, genomová DNA, cDNA, syntetické oligonukleotidy Výsledek absolutní kvantifikace závisí na 1.Volbě standardu 2.Good laboboratory practice Kvantifikační strategie − Velmi stabilní, odolné vůči náhodnému štěpení − Úseky DNA cca 2kb mají podobné vlastnosti jako mRNA/cDNA − Reprodukovatelné výsledky − Snadné stanovení koncetrace − Kalibrační křivky založené na DNA nereflektují RT krok − Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů Externí standardy Kvantifikační strategie RNA • RecRNA (rekombinantní RNA) – syntetizována přímo nebo in vitro z plazmidové DNA, obsahující klonovaný RTPCR fragment • Reverzní transkripce - Odlišná kinetika reakce jako u nativní RNA - Neodráží zastoupení jednotlivých RNA frakcí (rRNA 80%, tRNA 10-15% a další) • Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů • Stabilita a citlivost k nukleázám • Komerčně dodávaná celková RNA nebo její frakce (polyA, tRNA) jako tzv. background RNA – zvýšení účinnosti RT RecRNA Externí standardy Kvantifikační strategie Externí standardy Kvantifikační strategie Je nutné vytvářet pokaždé novou kalibrační křivku? Jaká je její reproducibilita? Předpokládáme stejnou instrumentaci, reagencie i templát (opakujeme stejnou kalibrační křivku) variabilitia 2-3% směrnice (k) y= k x + q 2-3% směrnice (k) 10% posun (q) - Některé přístroje (např. Roche Lightcycler) umožňují ukládání standardních křivek a jejich kalibraci (korekce q) prostřednictvím jediného datového budu v každé analýze (za předpokladu konzistentního designu analýzy) αααα Kvantifikační strategie Efekt počátečního počtu kopií Odhady množství templátu nad 1000 kopií jsou relativně přesné (chyba 1%) Ale - malý vstupní počet templátových molekul – chyba narůstá Např. účinnost PCR 80% → v každém cyklu pravděpodobnost 20%, že nedojde ke zdvojnásobení počtu molekul Monte Carlo effectMonte Carlo effect závisí na množství templátu – čím je menší množství templátu, tím je i menší pravděpodobnost, že množství amplikonu bude odrážet skutečné množství templátu (nárůst variability) Monte Carlo effect 100ng 10ng 1ng 0,1ng 0,01ng 0,001ng Přesto, lze úspěšně kvantifikovat i extrémně malá množství templátu: Stanovení 10 kopií genomu viru hepatitidy C v plazmě Intra-assay variabilita (CV) 3,1% Inter-assay CV 4,4% (4,15% CV pro 100000 kopií) 2. Relativní kvantifikace • Nevyžaduje externí standardy • Srovnání Ct jednotlivých vzorků (genů) (např. u pacienta po léčbě) s expresí referenčního genu (housekeeping gene) a vůči biologické kontrole • (např. pacient před léčbou, zdravý člověk…) • Kontrola = kalibrátor Kvantifikační strategie • Určení poměru exprese - ∆∆Ct - Korekce účinnosti PCR - Hodnocení skupin vzorků – software REST/REST XL 2. Relativní kvantifikace ∆∆Ct Kvantifikační strategie Bez zahrnutí efektivity jednotlivých reakcí Předpokládáme 100% R= 2-[∆Ct sample-∆Ct control] R=2-∆∆Ct A B c-fos vzorek c-fos GAPDH ∆Ct ∆∆Ct R A 22,00 18,18 3,82 0 1 B 22,34 15,76 6,58 2,76 1,15 A B GAPDH 0 0,5 1 1,5 A B Normalizovaná exprese c-fos vůči GAPDH 0 0,5 1 1,5 A B Nenormalizovaná exprese c-fos Kvantifikační strategie Korekce relativní kvantifikace zahrnující účinnost PCR Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek) (Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek) Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek) (Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek) Ratio = (Ereferenční gen) Ct vzorek (Ereferenční gen) Ct kalibrátor (Ecílový gen) Ct vzorek (Ecílový gen) Ct kalibrátor ÷ Účinnost PCR I malý rozdíl v účinnosti PCR mezi stanovovaným genem a referenční kontrolou může dramaticky změnit výsledný poměr Např. rozdíl v účinnosti (∆E) = 3% E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 47% E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 209% Kvantifikační strategie E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 209% E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 28% E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 338% E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 7,2% E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 1083% = 5% = 10% Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH. Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26 Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27 Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků? Pacienti: dCt=32-26 = 6Pacienti: dCt=32-26 = 6 Kontrola: dCt=35-27 = 8 ddCt: 6-8 = -2 Poměr exprese: 2-ddCt = 4 Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH. Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26 Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27 Efektivita PCR (YFG) 80%; (GAPDH) 90% Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků? Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek) (Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek) Ratio = 1,83 = 5,832 = 3,07 1,91 1,9 Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH. Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26 Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27 Efektivita PCR (YFG) 60%; (GAPDH) 105% Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků? Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek) (Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek) Ratio = 1,63 = 4,096 = 1,998 2,051 2,05 ! Kvantifikační strategie Normalizace v relativní kvantifikaci Sample-to-sample variation Run-to-run variation Korekce variability mezi jednotlivými vzorky, způsobené • Charakterem vzorků • Integritou RNA • Efektivitou RT• Efektivitou RT • Pipetovací chybou Normalizace vůči • Neregulovanému endogennímu referenčnímu genu • Celkové buněčné RNA/DNA Kvantifikační strategie Referenční geny Kvantifikační strategie GAPDH Albumin Aktin (y) Histon H3 Tubulin (y) GAPDH je regulovaná za nejrůznějších experimentálních i fyziologických podmínek Experimentální podmínky Tkáň Extracelulární faktory Onemocnění Věk Apoptóza Buněčný cyklus Vývojové stádium Leukocyty Erytrocyty Střevní biopsie Endothelie UV IL2 NO TPA Karcinom - prsu - cervixu - kolorekta Cyklofilin Mikroglobuliny (B2M) Ubiquitin 18SrRNA 28SrRNA Pseudogeny – specifická amplifikace nezávislá na mRNA Vývojové stádium Hladovění Hypoxie Oxidativní stres Těhotenství Sérum Endothelie T-lymfocyty Thyrocyty TPA Dexamethason Cholinergní agonisté Kreatin Inzulín Retinová kyselina Růstový hormon Vitamin D MnII+ - kolorekta - plic - jater - prostaty - slinivky Neurodegenerativní onemocnění Kvantifikační strategie Referenční geny Programy geNorm a BestKeeper (freeware) Určení expresních profilů více housekepingových genů, zhodnocení jejich variability (pairwise correlation), geometrický průměr více opakování Vyhodnocení nejstabilnějšího housekeepingového genu za definovaných podmínek. Jak na to? Tkáňové kultury – normalizace vůči počtu buněk, referenčnímu genu, RNA… – replikáty Mononukleární krevní buňky – heterogenní populace – FACS – normalizace vůči počtu buněk definovaného typu – kvantifikace vůči expresi genu pro příslušný CD (CD-19 B-lymf.) – totální RNA Kvantifikační strategie Jak na to? Biopsie solidních tkání - Nádorová tkáň - Heterogenita - Otázkou je, zda-li je vůbec objektivně možné relativně kvantifikovat klasické biopsie (problémy s referenčním genem a jeho expresí v daném místě, počtem buněk…) Laser Capture Microdissection - Normalizace exprese vůči referenčnímu genu- Normalizace exprese vůči referenčnímu genu - Výhodou je histologická informace a znalost počtu buněk Celková RNA - Nutné přesné určení koncentrace RNA - Nereflektuje RT a PCR krok rRNA - Jiný charakter exprese, jiné polymerázy, atd. - Její hladina je ale ovlivněna méně než v případě mRNA (s výjimkou krevních buněk) - Otázka volby subpopulace (28S, 18SrRNA) D'Souza et al. BMC Neuroscience 2008 9:66 doi:10.1186/1471-2202-9-66 Shrnutí Kvantifikační strategie Umíte odpovědět na následující otázky? – design experimentu, např. je vzorek tkáně reprezentativní? Jaké biologické kontrolní vzorky musím použít? – volba metody, jaký templát bude vstupovat do mých reakcí? mám použít pouze poly-A RNA nebo celkovou RNA? Má dostatečnou kvalitu? One step nebo two step PCR? – s jakou účinností běží moje PCR? – absolutní nebo relativní kvantifikace? – je zvolený housekeepingový gen vhodný? – proběhla má real-time PCR správně? Jsou Ct stanoveny správně? ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Podzim 2008 www.sci.muni.cz/LCD III. Instrumentace Instrumentace PCR – termocykler qRT-PCR – termocykler kombinovaný s fluorimetrem Excitačnífiltr Emisní filtr Detektor Halogenová lampa - Všechny vlnové délky viditelného světla (320nm – 2600nm) - Uniformní excitace - př. ABI 7300, 7500, Stratagene Mx4000/Mx3000p, BioRad iCycler - Normalizace fluorescence (Rox) Laser - Specifická vlnová délka Instrumentace Zdroje excitačního záření - Specifická vlnová délka - Není nutný excitační filtr - Omezený výběr fluoroforů - př. ABI PRISM 7700/7900 LED - Úzké pásmo vlnové délky (30-40nm) - Běžné LED emitují na 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm - nově i modrá a UV část spektra - př. Corbett Rotor-Gene, Roche Light Cycler Filtry Instrumentace Excitační/emisní – selekce excitační/emisní vlnové délky Optická kvalita filtru často určuje výkonnost přístroje Bandpass a Long Pass Filtry Volba fluoroforu http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/imagingsystems. html Monochromátor Volba libovolné vlnové délky Difrakční mřížka Instrumentace Fotodetektory Snímací zařízení (CCD ) Instrumentace Teplotní uniformita wincobiz.com/qpcr.htm. Instrumentace Parametry RT cykleru Citlivost – minimální kvantifikovatelné množství templátu – fluorescence, kterou je přístroj schopný odlišit od úrovně pozadí (šum) Dynamický rozsah – rozsah koncentrací – rozsah intenzity fluorescence Linearita – intenzita fluorescence je ideálně lineární ale:ale: - koncentrace: - vysoká koncentrace vzorku – nemusí dojít k excitaci - i u „normálních“ koncentrací, může dojít k preferenčnímu absorbování světla povrchovými vrstvami vzorku, vzdálenější část vzorku už není excitována světlem o stejné intenzitě - optická dráha - laboratorní plastik - homogenita vzorku Fluorescenční standardy – kalibrace přístroje Instrumentace Kalibrace