ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR IV. Interkalační barviva a sondy Fluorofor – většinou heterocyklická nebo polyaromatická sloučenina, při přechodu z excitovného do základního stavu fluoreskuje 10-15 sec. Excitace Fluorescence 10-9 sec. Fosforescence 10-3 sec. Fluorofor (F) Základní stav Excitovaný stav 10-15 sec. Relaxace Zhášení nebo přenos energie Vnitřní konverze Fluorescenční kvantový výtěžek (Fluorescence quantum yield, QY) – poměr emitovaných fotonů k absorbovaným. Molární extinkční (absorpční) koeficient – jak silně daná látka absorbuje světlo o dané vlnové délce A=εcl Fluorofor (F) Intenzitafluorescence Stokes shift Excitace Emise Stokesův posun; Jablonského diagram Vlnová délka [nm] 350 400 450 500 550 600 650 S’1 Základní stav Excitace Absorpce S1 S0 S’1 →S1 Disipace části energie Přechod z S1 do S0 a emise fluorescencehυex hυem Jablonského diagram Zhášení – quenching • Redukce QY v daném fluorescenčním ději • Absorpce nebo disipace energie – návrat fluoroforu do základního stavu bez emise fluorescence Proximální zhášení – kolizní quenching • Fluorofor velmi blízko zhášeče – přenos energie z F na Q ve formě tepla – nenastane žádná fluorescence Quenchers – Zhášeče (Q) nenastane žádná fluorescence • Proximální zhášeče: molekulární kyslík, Cu2+, Mn2+, NO3- http://www.etswebsite.be/ Základ řady experimentálních metod v biochemii a molekulární biologii • Přenos energie z donorové na blízkou akceptorovou molekulu, donor se vrací do základního stavu bez vyzáření fluorescence; akceptor vyzáří energii ve formě fluorescence • Emisní a absorpční spektra se musí překrývat • Főrsterova vzdálenost obv. 100Ǻ • Energie, kterou donor vyzáří nebo předá musí být dostatečná k excitaci akceptoru • Příklad: FAM-TAMRA, DABCYL, BHQ Fluorescenční rezonanční energetický transfer (FRET) hυ ex hυ ex hυ em hυ em FRET Specifická vs. nespecifická detekce amplikonu Nespecifická – Interkalační barviva – Quencher Labeled Primers – LUX Primers – Amplifluor Specifická Lineární sondy – ResonSense, Angler Probes – HyBeacons – Light-up probes – TaqMan sondy (Hydrolyzační sondy) – Lanthanidové sondy – Hybridizační sondy –– Eclipse – Displacement Hybridization/Complex Probes Strukturní sondy – Molekulární majáky – Scorpions – Cyclicons – Nanoparticle Probes – Konjugované polymery a PNA sondy Nespecifická detekce množství amplikonu – Interkalační barviva– Interkalační barviva – Quencher labeled Primer – LUX Primers – Amplifluor Interkalační barviva Reverzibilní vazba na dsDNA • Relativně levné • Citlivé Nevýhody: • Některá barviva se váží na ssDNA • Nespecifická vazba na jakoukoli dsDNA (primer dimery, „mispriming“, atd.) • Pečlivý návrh primerů a extenzivní validace, disociační křivky http://www.uic.edu/depts/rrc/cgf/realtime/melt.html Disociační křivky – melting curves 1 amplikon 2 amplikony Žádná amplifikace Ethidium bromid 30ti násobný nárůst fluorescence po vazbě na dsDNA Nepravidelná vazba na DNA Qy = 0,15 Mutagen SYBR Green SYBR Green II SYBR Gold YO (Oxazole Yellow) TO (Thiazole Orange) PG (PicoGreen) Interkalační barviva >1000 násobný nárůst fluorescence Rovnoměrná vazba na DNA Qy = 0,60 Bezpečný A) SYBR Green Interkalační barviva B) Ethidium bromide Quencher Labeled Primers 1 Použití dvou odlišných molekul PNA (peptide nucleic acid) označenou na C konci zhášečem DABCYL (Q-PNA) + Primer se specifickou sekvencí na 3’ konci a fluoroforem a PNA komplementární sekvencí na 5’ konci Tm primer/amplikon> Tm Q-PNA/primer > Ta primer 1. Nadbytek primerů je zhášen při Ta 2. Fluorescence měřená během Ta udává množství primerů hybridizovaných k templátu /amplikonu plus množství fluorescenčně označených dsDNA amplikonů 3. Real-time i end point Primer >25bp se zhášečem na 5’ konci (QSY 7, QSY 9), Molecular Probes-Invitrogen QSY 7/QSY9 zháší fluorescenci interkalačního barviva (SYBR), které se může vázat na primer dimery nebo primer samotný Po prodloužení řetězce není již fluorofor zhášený Redukce pozadí/ nespecifických signálů Quencher Labeled Primers 2 QSY 7 LUX Primery Light Upon eXtension – Invitrogen • Reverse nebo forward primer označený fluoroforem. • Ve vlásenkové konformaci zhášený. Druhý primer je neoznačený. • Po inkorporaci do dsDNA je zhášení uvolněno a emitována fluorescenceuvolněno a emitována fluorescence Amplifluor • 3 typy primerů - Dva specifické pro amplifikovanou sekvenci a jeden tzv. UniPrimer • Jeden ze specifických primerů obsahuje univerzální (Z) sekvenci na 5’ konci, druhý není nijak modifikovaný • 3’konec UniPrimeru je komplementární k Z sekvenci prvního primeru, zbytek směrem k 5’konci tvoří vlásenku označenou fluoroforem (FAM) a UniPrimer http://www.genxpress.at/ tvoří vlásenku označenou fluoroforem (FAM) a zhášečem (DABSYL) • výhoda: každá PCR může být snadno adaptována na Amplifluor PCR, začleněním Z sekvence na 5’konec jednoho z primerů • možnost použít dva různě značené UniPrimery s konci komplementárními k odlišným Z sekvencím – SNP analýza/alelická diskriminace Cyklus 1: primer se Z sekvencí je inkorporovaný do nově syntetizovaného řetězce Cyklus 2: polymerace z druhého primeru inkorporuje sekvenci komplementární k Z do druhého řetězce Cyklus 3: konec Uniprimeru se komplementárně váže k Z sekvenci, poskytuje volnou OH skupinu polymeráze a je sám začleněn do nově vznikajícího řetězce – uvolňuje se vlásenková konformace Cyklus 4: polymeráza uvolňuje vlásenkovou strukturu Amplifluor Cyklus 4: polymeráza uvolňuje vlásenkovou strukturu a celý Uniprimer se stává součástí nového řetězce. Zhášeč je oddělen od fluoroforu a dochází k emisi fluorescence. • Od tohoto cyklu je Uniprimer inkorporován do amplikonu • Fluorescenční signál je generován v každém PCR cyklu (je snímán během annealingu) a koreluje s množstvím amplikonu. • Nezačleněný Uniprimer tvoří vlásenku a nefluoreskuje. Amplifluor Specifická detekce množství amplikonu Lineární sondy –ResonSense, Angler Probes – HyBeacons Strukturní sondy – Molekulární majáky – Scorpions – – HyBeacons – Light-up probes – TaqMan sondy (Hydrolyzační sondy) – Lanthanidové sondy – Hybridizační sondy – Eclipse –Displacement Hybridization/Complex Probes – Cyclicons – Nanoparticle Probes – Konjugované polymery a PNA sondy Reson Sense & Angler Probes – urychlení qPCR - optimální fluorescenční signál již po 5 sec. v annealingovém kroku – DNA interkalátor (SYBR Gold) – FRET donor + sonda specifická k jedinému amplikonu – FRET akceptor (Cy5 na 5’konci) – buď volně (ResonSense) nebo připojena k primeru linkerem (Angler Probe) – DNA polymeráza bez exonukleázové aktivity v případě ResonSense – Pokud není přítomná cílová sekvence, nebo během denaturace, není SYBR a Cy5 v dostatečné blízkosti aby došlo k FRET a emisi fluorescence – kvantitativní PCR i alelická diskriminace (více různě značených sond) www.dstl.gov.uk – kvantitativní PCR i alelická diskriminace (více různě značených sond) ex 495nm em 537nm ex 495nm em 695nm SYBR gold SYBR gold cy5 FRET HyBeacons www.lgc.co.uk • Velmi jednoduchý princip i design • Sonda emituje fluorescenci pouze v duplexu s DNA • P na 3’OH konci – není volná OH skupina pro polymerázu • Snímání fluorescence v annealingovém kroku • Bez nutnosti FRET, návrhu sekundární struktury nebo enzymatického štěpení HyBeacons Rozlišení blízce příbuzných sekvencí na základě Tm umožňuje detekci SNP i kvantitativní analýzu www.lgc.co.uk Light Up Probes • Podobné HyBeacons • PNA s konjugovanou thiazolovou oranží (asymetrické cyaninové barvivo) • PNA neinterferuje s PCR • Nízká fluorescence volné sondy – nárůst po vazbě k DNA (annealingový krok – snímání fluorescence) • SNPs (jediná báze)• SNPs (jediná báze) 11mM LUP2 LUP2 Lys1-TAGCTGCT-- --CO-(CH2)5-TO-N Light Up Probes 55mM TCCTTCATTCGCTTC LUP2 nekomplementární 55mM ATCGACGAGACAGCTGGCGA LUP2 komplementární Svanvik et al. 2000. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry 281, 26–35 . Hydrolyzační sondy (TaqMan Probes) • 5’ nuclease assay • Velmi populární design a univerzální použití • Fluorofor na 5’, zhášeč na 3’ konci (snadná syntéza) • 5’-3’ ds exonukleázová aktivita DNA polymerázy • F-Q – FRET (TAMRA) nebo emise tepla (BHQ) • Pokud je přítomen templát, sonda se komplementárně váže na cílovou sekvenci – annealing • Hydrolýza sondy během extension fáze PCR (rozdíl od předchodzích) , uvolnění fluoroforu a ireverzibilní emise fluorescence Q Q předchodzích) , uvolnění fluoroforu a ireverzibilní emise fluorescence • Nenavázaná sonda zůstává intaktní a nedochází k fluorescenci • Je nutné sladit annealingovou teplotu proby s optimální teplotou polymerázy F Q F F F Q • Sloučení annealingového a extension kroku do jediného, obvykle 8-10°C pod Tm sondy (60-62°C) • Kvantifikace, SNP, alelická diskriminace atd. • Multiplexní reakce UPL sondy • Podobné TaqMan sondám • Sekvenčně specifický pár primerů + semiuniverzální sonda - knihovna • Do sekvence sondy začleněna Locked nucleic acid (LNA) – zvyšuje teplotní stabilitu – Tm Lanthanidové sondy • varianta hydrolyzačních sond (TaqMan) • fluorescenční zančka – lanthanidové cheláty (terbium, europium) s molekulami, schopnými absorpce UV – úzké emisní spektrum, • zhášeny ssDNA – řádový nárůst fluorescence po hydrolýze sondy • time resolved FRET – odečet fluorescence po určité době od excitačního pulzu – snížení fluorescence pozadípozadí • další snížení zbytkové nespecifické fluorescence pomocí krátké sondy se zhášečem – do cyklu je zařazen krok 35°C kdy se váže sonda se zháše čem na nenavázanou reportérovou sondu • kombinace s klasickými fluorofory Lightcycler - Hybridizační sondy • dva oligonukleotidy, navržené tak, aby hybridizovaly na templátu vedle sebe • fluorofory tvořící FRET pár • pouze po úspěšné hybridizaci dojde k emisi fluorescence FRET Emise fluorescence signál Sondy nehybridizují v dostatečné blízkosti – nedojde k FRET × signálEmise fluorescence • kvantifikace, genová exprese, SNP Eclipse • Lineární sondy, podobné TaqMan • 3’ konec – fluorofor, 5’ MGB protein a zhášeč • Nejsou hydrolyzovány Taq polymerázou • Pokud není Eclipse sonda hybridizována k templátu, zaujímá konformaci, ve které jsou fluorofor a zhášeč v těsné blízkosti • Přítomnost MGB zvyšuje účinek zhášeče – redukce fluorescence pozadí a umožňuje konstrukci kratších sond s vyšší Tm Displacement Hybridization/Complex Probes • v reakci kromě sondy a templátu je navíc kompetitor • kompetitor blokuje nespecifickou hybridizaci sondy k podobným sekvencím, ale nezasahuje do hybridizace mezi přesně odpovídajícím templátem a sondou • SNP – diskriminace rozdílu i v jediné bázi • fluorescence se měří v annealingové fázi Molekulární majáky/ Molecular beacons • vlásenková struktura, konce jsou vzájemně komplementární; smyčka je komplementární k cílové sekvenci • konce označeny fluoroforem a zhášečem • ve vlásenkové konformaci je fluorescence zhášena • po vazbě na komplementární templát dochází k emisi fluorescence • fluorescence je odečetena v annealingovém kroku • po zvýšení na extenzní teplotu, sonda disociuje a nebrání polymeraci • Stratagene Molekulární majáky/ Wavelength shifting beacons • sonda má na jednom konci navázané dva fluorofory – tzv. „harvester“ a „emitter“, na druhém konci zhášeč • harvester absorbuje světlo, emitter díky FRET fluoreskuje • výrazně jasnější výstup než klasické majáky (v případě běžných zdrojů monochromatického světla) Katalytické molekulární majáky • Molekulární maják je kombinovaný s DNAzymem • Lineární oligonukleotid (sonda) značený fluoroforem a zhášečem, intramolulekálrně komplementární k DNAzymu • Absence cílové sekvence – maják intramolekulárně hybridizuje s DNAzymem a alostericky inhibuje jeho aktivitu; sonda není štěpená • V přítomnosti cílové sekvence DNAzym štěpí sondu, odděluje zhášeč a dochází k emisi fluorescenceemisi fluorescence • Modulární design umožňuje různé assaye Katalytické molekulární majáky PNA Molekulární majáky • Klasické majáky špatně hybridizují ke komplementární ssDNA v roztocích o nízké iontové síle, poměr signál/šum je různý, ale zvyšuje se s rostoucí iontovou silou • „stemless“ majáky výborně hybridizují i za nízkých koncentrací solí, ale mají nízký poměr signál/šum • PNA „stemless“ majáky kombinují výhody obou systémů• PNA „stemless“ majáky kombinují výhody obou systémů • Výhody: - Neobsahují jiné sekvence než komplementární k cílové molekule výrazné urychlení kinetiky reakce - Rezistentní k nukleázám - Necitlivé k přítomnosti DNA vazebných proteinů - Účinné i v nízké iontové síle a při vyšších teplotách Scorpion primers • kombinace sondy a primeru v jediné molekule • nedochází k enzymatickému štěpení – rychlejší proces • poměr amplikonů a hybridizovaných sond (tedy i fluorescence) 1:1 • vlásenková struktura - sonda (specifická sekvence) kovalentně vázaný primer • PCR blocker – zabraňuje replikaci sekvence sondy a tedy i nespecifickému fluorescenčnímu signálu • zhášení fluoroforu je zajišteno separátním oligonukleotidemoligonukleotidem • Nízké pozadí • Rychlá analýza • Jednoduchý design • SNP – vysoká citlivost • Multiplex • Jednoduchá příprava Scorpion primers Cyclicons • Pseudocyklické oligonukleotidy (PCO) – dva oligonukleotidy spojené v oblastech 3’-3’ a 5’-5’ • Jeden segment je komplementární k cílové sekvenci • Druhý segment 5-8 nukleotidů je komplementární k 3’ nebo 5’ antisense oligonukleotidu • Pokud není přítomný templát, PCO tvoří intramolekulární pseudocyklické struktury, • Hybridní materiály složené z biomolekul (oligonukleotidy) a anorganických látek – např. zlaté koloidní nanočástice • kovové clustery – efektivní zhášeče • hybridní konjugát – ssDNA oligonukleotid, 1,4nm zlatá nanočástice a fluorescenční barvivo • 5’ a 3’ konce oligonukleotidu jsou vzájemně komplementární, struktura podobná molekulárnímu majáku Výhody • Au nanočástice zhášejí fluorescenci např. 100x účiněji než DABCYL a mají téměř 100% Sondy založené na nanočásticích (nanoparticles probes) • Au nanočástice zhášejí fluorescenci např. 100x účiněji než DABCYL a mají téměř 100% účinnost zhášení pro fluorofory absorbující v IR části spektra (Texas Red, Cy5) • V přítomnosti cílové sekvence se vlásenka otvírá, odděluje se F a Q a dochází k emisi fluorescence Nevýhody • Nižší citlivost – řešení změna velikosti nanočástic, Surface plasmon resonance • Změna absorpčního spektra v závislosti na vlnové délce • Vazba Au-DNA Au nanoparticle Konjugované polymery a PNA sondy • Cíl – zjednodušení syntézy sond, zvýšení citlivosti • Vývoj kationtových konjugovaných polymerů CCPs • Delokalizovaná elektronová struktura, vazba na DNA • PNA sonda s navázaným fluoroforem • V případě tvorby ideálního duplexu DNA/PNA, se CCP dostává do blízkosti fluoroforu a dochází k FRET • Pokud není cíl přítomný, CCP se váže pouze na DNA a dochází pouze k fluorescenci CCP, ne FRET • Efektivní detekce SNP Fluorescence po přímé excitaci fluoresceinu Fluorescence po excitaci CCP komplexu Shrnutí - Princip fungování real-time termocykleru - Základní principy excitace a emise fluorescence, FRET, zhášení - Interkalační barviva - Lineární a strukturní sondy - Hydrolyzační sondy (Taq-Man) ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primerů a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR − Sekvence − Koncentrace solí − Tvorba heterodimerických stabilních struktur Design primerů a sond − Párování bazí - nejen Watson a Crick − Sekundární struktura − Teplota tání DNA Tm • jeden z nejdůlěžitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm – teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting“ – usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: A====T <<<< G≡≡≡≡C • • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami Melting temperature Tm Design primerů a sond • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) Tm=81,5+16,6 (log10[Na+]+0,41(%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory http://insilico.ehu.es/tm.php Melting temperature Tm Design primerů a sond Gibbsova (volná) energie a její změna (∆G, ∆G0) • Sekundární struktura DNA • Na rozdíl od Tm, ∆G závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie ∆G0 (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teoploty a tlaku) - spontánní reakce - ∆∆∆∆G<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur Design primerů a sond mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček – predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions – smyčky, vlásenky, výdutě atd. 1. Počet odpovídajících párů bazí - Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí - Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence – nearest neighbor 3. Sekundární struktura - Charakter cílové sekvence Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu Design primerů a sond - Charakter cílové sekvence - Kompetice primeru nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce - Interakce mez 5’ a 3’ konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze - Příklad: ∆G0 (GC) -0,96kcal/mol ∆G0 (AT) -0,50 kcal/mol ∆G0 W-C (TA/AT) -0,58ckcal/mol ∆G0 W-C (GC/CG) -2,24 kcal/mol GTAGACAATCTCCATCTCCTATCCTGATTAGAG ******************** GTTAGAGGTAGAGGATAGGA 5. Iontová síla - Koncentrace iontů, zejména MgII+ - Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu - Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu Design primerů a sond 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA – vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hybridizace obou primerů. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou ∆G0, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající ∆G0. Design primerů • Optimálně: primery jejichž 5’konce tvoří stabilní duplex, ∆G0 <10 kcal/mol/37°C • Plynulý přechod ∆G0 směrem k 3’konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3’konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primerů – primer dimery Design primerů a sond • Specifita – hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí – i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR – vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR Design sond • Různý design podle toho, zda je cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče Design primerů a sond • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy – LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design primerů a sond Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový prodes – denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší ∆R (∆Rn) • Umístění 5’ konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3’ konci jednoho z primerů – účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence – začlenění LNA, PNA nebo MGP • G – účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém • Tm proby od 10°°C vyšší než Tm primer ů F Q F F F Q Q Q Design primerů a sond Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) • Sondy by měly být umístěny co nejdál od primeru 5’ – odečet fluorescence v annealingové fázi • GC 50% • Každá sonda má délku 23-35bp • Sondy o stejné Tm – musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10°C vyšší než Tm primerů • 3’ konec akceptorové sondy fosforylován • Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 • Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění FRET) Design primerů a sond Design molekulárních majáků • Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu • Tm komplementárních ramen o 7-10°C vyšší než Tm pr imerů • Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers Sonda připojena k 5’ konci primeru a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy