ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě …) - Sledování minimální reziduální nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduální onemocnění (Her2 – karcinom prsu, Bcr-Abl – CML, ELAVL-4 – neuroblastom) Aplikace (Her2 – karcinom prsu, Bcr-Abl – CML, ELAVL-4 – neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA – karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP a alelická diskriminace 4. High Resolution Melting Analysis 5. Kvantifikace množství (konkrétních) proteinů Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody – časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR – např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum – testování antibiotik – multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 000g Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) – oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5’-AATACCCGATGTTGTCCACA-3’ Reverse: 5’-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3’ Reakční směs 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0µl Forward primer (10µM) 2,0µl Reverse primer (10µM) 2,0µl PCR grade H2O 15,0µl Vzorek DNA nebo standard 5,0µl PCR 95°C 1min 95°C 15s 60°C 1min Disociační křivka – 60-95°C Aplikace v klinické virologii Aplikace Typizace virů (např. chřipka) - nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky - Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace – virový titr - např. hepatitida B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. - Transplantace Detekční limity – genomové ekvivalenty (ge)Detekční limity – genomové ekvivalenty (ge) - End-point analýza – detekční limit 5×101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge - Hybridizační analýzy - detekční limit 2×101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% - qRT-PCR - detekční limit 1×101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv. „Spiking“ vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) – 5’ nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) – oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3’ Reverse: 5’-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3’ Aplikace Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs – One Step PCR (Qiagen) Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0µl Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0µl Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0µl Forward primer (10µM) 2,0µl Reverse primer (10µM) 2,0µl Sonda (20µM) 0,2µl PCR grade H2O 8,8µl Vzorek DNA nebo standard 5,0µl PCR 50°C 20min (Reverzní transkripce) 95°C 15min (Aktivace polymerázy) 95°C 15s 60°C 1min Aplikace Terénní qRT-PCR – Detekce patogenů mimo laboratoř – Komerční specializovaná řešení – „Lab on chip“ http://www.idahotec.com/BioDefense/ http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfism SNP - DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu - Kódující i nekódující oblasti - Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA - Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. - Senzitivita k onemocněním - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Aplikace • Invader assay (Flap endonukleáza) • Denaturační gradientová gelová elektroforéza • Sekvenování • SNP microarray SNP genotypizace Aplikace Tetra-primer based PCRAPEX (Arrayed primer extension) – 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5’koncem – PCR produkt je hybridiziován a prodloužen DNA polymerázou – Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy SNP genotypizace Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis ― Analýza komplexních sekvencí ― PostPCR analýza ― Snadná analýza neznámých sekvencí ― Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě VÝHODA: ČAS Aplikace Výhody: - Univerzální primery pro oblast nesoucí hledaný polymorfismus - Jediný fluorofor (SYBR Green) - „High throughput“, automatizace Aplikace: Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Erali M. et al. 2010. Methods 50(4):250-261 Aplikace: - SNP, mutace - genotypizace - Typizace mikroorganismů Příklad: Screening X-linked chronic granulomatous disease (OMIM 300481) 13 exonů + amelogenin alternativa: sekvenování Aplikace Aplikace Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21mery - regulují expresi genů vazbou na 3’ nepřekládaný region mRNA (3’UTR) Aplikace Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Kritický bod: Izolace subpopulace malých RNA Aplikace Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce • Specifický primer pro RT • 5’ nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA (snRNA) Analýza DNA metylací Aplikace • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory C + bisulfit = U mC intaktní mC vs. C mC vs. CmC intaktní Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, HpaII, MspI and HhaI mC vs. C Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primerů nebo 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace ImunoPCR – Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce – Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou – Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay – Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR Aplikace ImunoPCR Aplikace ImunoPCR – stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Single cell profiling Aplikace Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Circulating tumor cells (CTCs) Aplikace Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Circulating tumor cells (CTCs) Aplikace Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Circulating tumor cells (CTCs) Aplikace Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Aplikace Amplifikace DNA bez PCR? Helicase-dependent isothermal DNA amplification 1. dsDNA je denaturována pomocí helikáz a SSB proteinů 2. Primery hybridizují ke komplemntární sekvenci 3. Polymeráza doplní ssDNA na dsDNA, která slouží jako substrát helikázám ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VII. Troubleshooting Problémy v qRT-PCR analýze Jak vypadá správný amplifikační výstup? Ct 18,06 18,04 Duplikátní reakce • Exponenciální amplifikace • Identická amplifikace • Podobné/shodné Ct • Odpovídající fluorescence jednotlivých reportérů Problémy v qRT-PCR analýze Problém 1: Příliš mnoho templátu • Vysoká hodnota pozadí • Fluorescence v prvních cyklech (ze kterých se počítá baseline) je vyšší, než fluorescence na konci reakce Řešení: • Ředit templát 1:100 – 1:1000 a zopakovat PCR • Změnit manuálně treshold nebo nastavení baseline• Změnit manuálně treshold nebo nastavení baseline Baseline 3.-25. cyklus Baseline 3.-13 cyklus Problémy v qRT-PCR analýze Problém 2: Amlifikace není exponenciální Pravděpodobně přítomnost inhibitorů v konkrétním vzorku Řešení: Ředění templátu 1:10-100 Ct 16,07 – 21,97 Ct 37,86-38,64 „Undetermined“ Problémy v qRT-PCR analýze Problém 3: Ct duplikátních reakcí se výrazně liší • pravděpodobně nedošlo k amplifikaci • gelová elektroforéza PCR reakcí nebo • multikomponentní záznam fluorescence FAM duplikát 1 Duplikát 2 Duplikát 1 • nepřesné pipetování, Monte Carlo efekt, přítomnost inhibitoru v reakci Řešení: • Zopakovat reakce nebo (pokud už nemáme vzorky) • vzít v úvahu Ct z exponenciální reakce • přijít na příčinu problému (otestovat příslušnou jamku v bloku, reagencie atd.) FAM duplikát 2 RO X Problémy v qRT-PCR analýze Problém 4: Nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku Řešení: • Zopakovat reakce včetně pozitivní kontroly • Pokud opět nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku, zkontrolovat společné chemikálie (voda, master mix, sonda)master mix, sonda) • Zkontrolovat reakci na agarózovém gelu a vyloučit selhání sondy, eventuálně provést reakci spolu se SYBR green • Pokud se problém vyskytuje pouze u některých vzoků je problém s těmito vzorky (kvalita templátu, inhibice) Problémy v qRT-PCR analýze Problém 5: Nefunguje sonda Řešení: • Vyloučit lidskou chybu, přítomnost inhibitorů, nekvalitní templát, chyby v RT • Kontrola pomocí SYBR Green nebo v agarózovém gelu • Pokud je vyloučeno selhání amplifikace, provést test s DNázou I• Pokud je vyloučeno selhání amplifikace, provést test s DNázou I DNázaI - oddělí fluorofor od zhášeče a umožní fluorescenci - problémy ve značení nebo purifikaci sondy Problémy v qRT-PCR analýze Problém 6: Směrnice kalibrační křivky je menší než -3,3 • Efektivita PCR reakce je menší než 100% Řešení: • chyba výpočtu, inhibitory v reakci, chyba při pipetování • nové standardy • kontaminace templátu, koncentrace MgCl• kontaminace templátu, koncentrace MgCl2 y = -4,5144x + 36,21 R² = 0,9934 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 28,5 29 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 Problémy v qRT-PCR analýze Problém 7: Směrnice kalibrační křivky je větší než -3,3 • Účinnost PCR vyšší než 100% • V případě specifické detekce (TaqMan) většinou pipetovací chyby nebo chyby ředění - event. změnit některé parametry analýzy (zejména baseline) • SYBR Green – možné nespecifické produkty (primer dimery) Řešení: • nová reakce • optimalizace PCR Problémy v qRT-PCR analýze Problém 8: Nelze naředit standardy na nižší koncentraci • Přítomnost kontaminující DNA Řešení: • nové standardy • ověřit čistotu RNA vstupující do procesu Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají divně • příliš mnoho templátu • chybné nastavení baseline Řešení: • naředit vzorky • změnit nastavení baseline – vyloučit cykly,• změnit nastavení baseline – vyloučit cykly, ve kterých je abnormální fluorescence • změnit algoritmus výpočtu Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají divně • změnit algoritmus výpočtu – tzv. adaptivní nastavení baseline – pro každý cyklus jednotlivě Problémy v qRT-PCR analýze Po této předášce máte představu o tom, jak: • Má vypadat správný průběh real-time PCR • Jak nemají vypadat výstupy • Kdy nevěřit svým datům a jak je ověřit • Jak vyřešit některé běžné problémy s amplifikací ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Podzim 2010 9. Úvahy nad experimentálním designem Statistické minimum & MIQE Minimum standard for the provision of information in quantitative PCR Kvantifikační strategie Statistické vyhodnocení Nulová hypotéza (není rozdíl), kterou se test buď potvrdí nebo vyvrátí Základní statistické parametry – průměr ± SD nebo medián ± x-percentil Parametrické testy - Normální rozložení - Stejný rozptyl - Dva vzorky t-test (one/two tailed) - Různé nezávislé proměnné - ANOVA (i tehdy, není-li rozložení úplně Gaussovské) Genová exprese (expresní poměry) mívá obvykle normální rozložení, pokud je vyjádřena v log scale. Neparametrické testy - Neznáme parametry rozložení - Testování rozdílů mezi nezávislými skupinami (Independent samples) dva vzorky, u kterých porovnáváme průměry některé z proměnných - Mann-Whitey U test; Kolmogorov-Smirnov test více skupin - Kruskal-Wallis test; Mediánový test Kvantifikační strategie Statistické vyhodnocení - Kruskal-Wallis test; Mediánový test -Testování rozdílů mezi závislými skupinami - Porovnávání proměnných, zjišťovaných na jednom vzorku - Wilcoxonův test (parametrická alternativa – t-test/ANOVA) - Hodnoty typu „mRNA přítomná/nepřítomná“ (dichotomické hodnoty) – McNemarův χ2 test -Testování vztahů mezi proměnnými - Regrese a korelace (Spearmanův/Pearsonův korelační koeficient) - Standardní křivky Kdy použít který test Parametrické vs. neparametrické testy RT-PCR Obvykle malý počet hodnot, s velkým rozptylem, většinou nesledujících normální rozložení -> neparametrické testy V případě většího počtu hodnot (>100), lze použít parametrické testy Kvantifikační strategie Statistické vyhodnocení V případě většího počtu hodnot (>100), lze použít parametrické testy Neparametrické testy jsou méně náchylné k α-chybám (nesprávné zamítnutí nulové hypotézy), ale jsou méně citlivé než parametrické (např. srovnání p u para < p u neparametrických testů), jako signifikantní označí větší rozdíl než parametrické testy. Statistické vyhodnocení Kvantifikační strategie Analýza více genů/vzorků (clustering) Dvourozměrný graf Třírozměrný graf 250 300 0 50 100 150 200 0 20 40 60 80 100 Statistické vyhodnocení Kvantifikační strategie Analýza více genů/vzorků (hledání trendů, clustering) N různých genů – n různých proměnných – n rozměrný graf ? Př. 10000 genů… (microarray) Principal component analysis (PCA) Redukce počtu rozměrů (dimenzionality) na základě výpočtu kovariance mezi jednotlivými vzorky. Původní osy jdou nahrazeny tzv. komponentami Statistické vyhodnocení – shluková (clusterová) analýza Kvantifikační strategie Dendrogramy Statistické vyhodnocení – shluková (clusterová) analýza Kvantifikační strategie Self organizing maps (ANN, Kohonen) www.multid.se Kontrola dat (outliers) Úprava efektivity PCR Kompenzace variability mezi jednotlivými PCR (inter-plate calibration) Normalizace na stejné množství vzorku (RNA/DNA) Kritická místa statistického vyhodnocení Průměrování technických replikátů Výpočet množství/poměrů Vlastní statistická analýza Variabilita a její příčiny Biologická variabilita – experimenty odrážejí různorodost reality – nebudou nikdy identické Technická variabilita – chyby v měření, znemožňující adekvátní popis reality Experimentální design – chybná hypotéza vedoucí k výsledků platným pouze v rámci experimentu – biologické nebo klinické významnosti – data overestimation Bustin SA. 2010. Methods 50(4):217-226. Biologická variabilita Biologická variabilita • kombinace genotypových a fenotypových variací mezi jedinci • tkáně a buňky – dynamické systémy se schopností komplexní adaptace a reakce na různé podmínky Genetická variabilita polymorfismy, copy-number variace, alternativní splicing,polymorfismy, copy-number variace, alternativní splicing, posttranskripční a posttranslační regulace, epigenetické modifikace Fenotypová variabilita environmentální interakce, intra- a extraindividuální faktory (věk, životní/reprodukční cyklus, pohlaví, čas, nutriční stav…) Stochastická variabilita na úrovni kinetického šumu biochemických reakcí uvnitř jediné buňky = dynamické chování jediné buňky není přesně reprodukovatelné Biologická variabilita Expresní profily jednotlivých buněk se liší,Expresní profily jednotlivých buněk se liší, i v rámci homogenní kultury Interakce mezi regulačními molekulami a DNA Lokalizace mRNA a proteinů v rámci buňky Epigenetické modifikace I geneticky identické buňky ve stejném prostředí mohou mít různý fenotyp Biologické informační dráhy jsou robustní, redundantní, závislé na buněčném, tkáňovém i environmentálním kontextu Biologická variabilita Biologicky relevantní interpretace pozorovaného jevu a jeho odlišení odpozorovaného jevu a jeho odlišení od přirozené variability a heterogenity v daném systému vyžaduje správný experimentální design, analytické metody a vhodný statistický model Slepě nepřejímat cizí protokoly, přemýšlet Technická variabilitaTechnická variabilita jednoduchá, snadná, rychlá, citlivá metoda → Popularita ve vědecké komunitě Technická variabilita PCR & qPCR adaptace, úpravy, specifikace protokolů… → Publikace dat s různou kvalitou problematická data zpochybňují i oprávněné interpretace → Nutnost standardů Technická variabilita Bustin SA. 2010. Methods 50(4):217-226. Cíle standardizace Bustin SA. 2010. Methods 50(4):217-226. Technická variabilita Bustin SA. 2010. Methods 50(4):217-226. Experimentální design Derveaux S. et al. 2010. Methods 50(4):227-230. 1. Plán 2. Izolace RNA Typický experiment 3. RT 4. qPCR Minimalizace propagace technických chyb (errors of measurement) v experimentu Gene vs. sample maximization Technické chyby jsou nezávislé v každém experimentálním kroku a aditivní Plánování experimentu – příklad: exprese jednoho genu ve dvou myších: Subjekty Vzorky RT PCR Schéma: např. 2 x 3 x 3 x 3 2 3 3 3 myši 3 odběry vzorků a izolace RNA 3 RT ze každého vzorku 3 PCR replikáty z každé RT 2 6 18 54 Kitchen RR et al. 2010. Methods 50(4):231-236. Každý krok vnáší do analýzy variabilitu, kterou lze charakterizovat Kitchen RR et al. 2010. Methods 50(4):231-236. Určení faktorů , které omezují variabilitu systému umožňuje kalkulovat náklady powerNest www.powernest.net Kitchen RR et al. 2010. Methods 50(4):231-236. Conclusion Jak navrhnout správný experiment? – Definovat jej před vlastním začátkem experimentu – Brát v úvahu hypotézu – Být maximálně jednoduchý (co nejméně komplexní) – Maximálně kontrolovatelný – Technicky a ekonomicky proveditelný, statisticky vyhodnotitelný Variabilita dat Nežádoucí Technická: zpracování vzorku (sampling, izolace, RT-PCR) Řešení: replikáty, normalizace k internímu standardu Biologická: rozdíly mezi vzorky (bazální exprese, odpověď na treatment) Řešení: opakovaná měření, normalizace ke kontrolní skupině Hledaná Rozdíly mezi testovanými skupinami Náhodný sampling, velký soubor