Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR


                                               Den 1


Úkol č. 1: Izolace celkové RNA z buněčných linií, změřění její koncentrace a čistoty


Číslo skupiny

             Buněčná linie

                          S činidlem

                                     Bez činidla

1

             HL-60

                          ATRA

                                     1x

2

             U937

                          TPA

                                     1x

3

             T98G

                          Temozolomid

                                     1x


RNeasy Mini Kit (Qiagen)


- Přidat β-merkaptoetanol: 10 μl na 1 ml RLT pufru


 1. Každý vzorek rozsuspendovat v 1200 μl RLT pufru, vortexovat
 2. Každý vzorek nanást na kolonu QIAshredder umístěnou ve 2 ml zkumavce (rozdělíme na 2 samostatné
shreddery)
 3. Centrifugovat 2 min, max. rychlost (14.5000 rpm)
 4. Přidat 1 objem 70% EtOH k supernatantu, promíchat pipetou
 5. Pipetovat po 600 μl na Minispin kolonky
  + Centrifugace 15s/11.000 rpm, supernatant odstranit
 6. Na stejnou Minispin kolonku napipetovat podruhé 600 μl
  + Centrifugace 15s/11.000 rpm, supernatant odstranit
 7. Přidat  700 μl RW1 pufru na kolonku
  + centrifugace 15s / 11000 rpm, slít supernatant
 8. Přidat 500 μl RPE pufru na kolonku, rychle převrátit
  + centrifugace 15s / 11000 rpm, slít supernatant
 9. Přidat 500 μl RPE pufru na kolonku, rychle převrátit
  + centrifugace 2 min / 11000 rpm, slít supernatant
10. Centrifugace 1 min na max rychlost
11. Kolonky umístit do nové 1,5 ml eppendorfky, přidat 40 μl RNase free vody ke vzorkům
  + Nechat stát cca 5 min
  + Centrifugace 1 min / 11000 rpm
12. Změřit koncentraci RNA a čistotu na nanodropu (pozor, poměry absorbance při 260/280 nm a
260/230 nm musí být větší než 1,5)






Úkol č. 2: Reverzní transkripce RNA do cDNA


Každý vzorek přepsat 2x.


U každého vzorku je nutné přepsat také jeho No RT kontrolu.


Transcriptor kit (Roche)


1.    1,5 μg celkové RNA s 2 μl náhodných hexamerů doplnit vodou na celkový objem 13 μl (na ledu)

RNA

               x μl (celkem 1,5 µg)

Random hexamers

               2 μl

H[2]O

               Doplnit do 13 μl



2.    Inkubovat 10 min/ 65°C. Po skončení inkubace ochladit na 0°C.

3.    Do každé zkumavky přidat 7 μl mixu podle tabulky (pozor, u No RT kontrol bude mix místo
reverzní transkriptázy obsahovat vodu):

RT Buffer

                     4 μl

RNase inhibitor

                     0,5 μl

10 mM dNTPs

                     2 μl

Reverse transcriptase

                     0,5 μl



4.    Pokračovat v inkubaci 25°C / 10 min, 55°C / 30 min, 85°C / 5 min, 0°C / forever

5.    Uložit cDNA v -20°C