Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR


                                               Den 2


Úkol č. 3: Kalibrační křivky – Taqman sondy


1.      Sériově naředit cDNA – 10X; do reakce 2 μl, 6 datových bodů

- přepsaná cDNA má koncentraci 75 ng/μl (celkový objem je 20 μl)

- jednotlivé reakce budou obsahovat: 150 ng (bez ředění), 15 ng, 1,5 ng, 150 pg,
15 pg, 1,5 pg

2.      Připravit mastermix pro požadovaný počet reakcí dle tabulky



                                     Objem [μl]


                                     1x

                                         25x

2x Gene Expression Master Mix

                                     12,5

                                         312,5

Gene Expression Assay (cyclin D1-FAM)

                                     1,25

                                         31,25

Endogenous Control (GAPDH–VIC)

                                     1,25

                                         31,25

cDNA

                                     2

                                         -

PCR voda

                                     8

                                         200


3.      Do každé jamky na 96 jamkové destičce pipetovat 23 μl takto připraveného mastermixu

(triplikáty)

4.      Do každé jamky nepipetovat 2 μl cDNA odpovídajícího ředění

5.      Do jamek sloužících jako No Template Control napipetovat 2 μl PCR vody

6.      Provést qRT-PCR, po skončení běhu stanovit Treshold a jednotlivé Cts

7.      Vypočítat účinnost PCR z grafu log. ředění vs. Ct















Úkol č. 4: Optimalizace koncentrace primerů pro analýzu pomocí SYBR green


Cílem je otestovat, která z kombinací koncentrací primerů bude nejvhodnější (nízké Ct, absence
nespecifické amplifikace)


Postup:

1.      Přepsanou cDNA (koncentrace 75 ng/µl) zředit 5x.

2.      Zředit zásobní roztok primerů (GAPDH, 100mM) na výslednou koncentraci 5mM
a 2,5mM*

3.      Podle tabulky připravit a rozpipetovat 96 jamkovou destičku (hodnoty v tabulce jsou v ml)