Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR


                                               Den 3


Úkol č. 5: qRT-PCR analýza exprese a vliv inhibitorů na průběh PCR


Skupina 1 a 3:

Cíl: Najít rozdíl v expresi genu zájmu v buňkách ošetřených nebo neošetřených TPA, případně ATRA, a
zjistit, zda přítomnost ethanolu ovlivňuje průběh PCR reakce.

cDNA do reakce – upřesnění podle výsledků kalibračních křivek.

Pracovat v duplexu = v jedné jamce je jak sonda pro cycD1 (FAM), tak pro GAPDH (VIC).

Každý vzorek v triplikátu + NO RNA (přidám vodu) a NO RT kontroly.

Obdobně připravit 2 triplikáty s přidaným ethanolem na úkor vody – do jednoho triplikátu přidat 1
μl a do druhého 0,5 μl čistého ethanolu.


Skupina 2:

Skupina SYBR green

Cíl: Charakterizovat účinek EtOH na průběh a efektivitu qPCR

Složení PCR shodné jako v případě optimalizace primerů - koncentrace primerů určena podle

výsledků optimalizace.


Kalibrační křivky: Sériové ředění

1.      Ředicí varianty: Sériově naředit cDNA – 10X; do reakce 2 μl, 6 datových bodů

- přepsaná cDNA má koncentraci 75 ng/μl (celkový objem je 20 μl)

- jednotlivé reakce budou obsahovat: 150 ng (bez ředění), 15 ng, 1,5 ng, 150 pg,
15 pg, 1,5 pg



Na destičku připravit dvě varianty kalibračních řad:

1. kontrolní – bez ovlivnění

2. 2% EtOH (zásobní 100%) – na úkor vody v mastermixu


Složení SYBR green experimentu shodné jako v případě optimalizace primerů - koncentrace primerů
určena podle výsledků optimalizace.

Každý vzorek v triplikátu + NO RNA (přidám vodu) a NO RT kontroly.



















Kalibrační křivka

                                         množství templátu

                                               (ng)

                                                                                                   log množství (pg)

                                                                                                                       průměrná Ct

                                                100

                                                                                                           6

                                                                                                                          16,51

                                                10

                                                                                                           5

                                                                                                                          20,68

                                                 1

                                                                                                           4

                                                                                                                          23,73

                                                0,1

                                                                                                           3

                                                                                                                          26,57

                                               0,01

                                                                                                           2

                                                                                                                          29,76

                                               0,001

                                                                                                           1

                                                                                                                          32,99



Výpočet účinnosti reakce: v excelu – formát spojnice trendu, možnosti, zaškrtnou zobrazit rovnici
regrese a zobrazit hodnotu spolehlivosti R

y = kx + q

y = -3,2126x + 23,435

R² = 0,9968

E = 10 ^-1/k

E = 10 ^-1/-3,2126 = 10 ^0,311 = 2,046

E % = (2,046 – 1) 100 = 104 %