Bi9310c Úvod do kvantitativní RT-PCR – cvičení Zadání úlohy pro doktorské studenty Úvod: Studujete vliv látky X na plicní buňky. Při experimentech pomocí microarrays jste zjistili, že látka X ovlivňuje hladiny mRNA 5 genů asociovaných s plicním surfaktantem. Jedná se o geny SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC a SFTPD. Rozhodnete se ověřit zjištěné výsledky pomocí two step qPCR (zpětná transkripce a vlastní PCR reakce se dělají zvlášť). Rozhodli jste se pro relativní kvantifikaci a jako referenční gen jste na základě doporučení z literatury pro danou tkáň zvolili GAPDH (budete pracovat v duplexu, tedy sonda pro GAPDH a pro gen zájmu budou v jedné jamce). Právě vám dodali nový přístroj (který se kalibruje pomocí ROXu) včetně spotřebních plastů. cDNA z vašich buněk již také máte k dispozici. Jedná se o následující vzorky: Buňky X 0 X 0,25 ng/ml X 2,5 ng/ml X 25 ng/ml X 250 ng/ml X 2500 ng/ml Linie A 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky Linie B 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky Primární kultura 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky 3 misky Úkoly: a) Připravte seznam věcí, které potřebujete objednat pro váš qPCR experiment (včetně kódů a cen) od firmy Applied Biosystems (tabulka uvádí složení jedné jamky v 96 jamkové destičce). Objem [μl] 2x Gene Expression Master Mix 12,5 Gene Expression Assay (gen zájmu-FAM) 1,25 Endogenous Control (GAPDH–VIC) 1,25 cDNA 2 PCR voda 8 Celkem 25 Váš šéf počítá každou korunu, proto vám dal za úkol spočítat i variantu s chemií od firmy Roche (pozn.: pokud šéfa překvapíte a nachystáte 2. variantu od nějaké jiné firmy, zlobit se nebude). Koncentrace Objem [μl] Primer Mix (UPL Ref. Gene Assay) 20 μM 0,4 Probe (UPL Ref. Gene Assay) 10 μM 0,4 Primer (GOI) forward 20 μM 0,4 Primer (GOI) reverse 20 μM 0,4 UPL probe (GOI) 10 μM 0,4 LightCycler® TaqMan® Master 5x 4,0 PCR voda 9 cDNA 5 Celkem 20 Design primerů a výběr sondy od firmy Roche se provádí přes stránky Universal probe library: http://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/ezhome.html Pro každý biologický vzorek budete pipetovat 3 pokusné jamky + 1 jamku No RT kontroly (při zpětné transkripci nebyla použita reverzní transkriptáza). Na každou 96 jamkovou destičku napipetujete 5 vzorků No template kontroly (voda místo cDNA, značí se NTC nebo No RNA). Předtím je zapotřebí udělat kalibrační křivky pro zjištění efektivity PCR pro referenční gen i všech genů zájmu. Za tímto účelem použijeme RNA z neovlivněných buněk linie A. RNA, resp. přepsanou cDNA zředíme a do reakce ji budeme dávkovat v 6 různých množstvích (100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg a 1 pg). Každou koncentraci pipetujeme na destičku v triplikátu + 2 kontroly pro každou sondu (viz bod b)). b) Na dokumentovém serveru naleznete 3 soubory. V jednom (Kalibrace 1 a 2 - rozvržení destiček.xls) je zobrazeno rozložení vzorků tak, jak jste je pipetovali na destičku za účelem sestavení kalibračních křivek pro jednotlivé proteiny. Ve zbylých dvou (Kalibrace_1-28-11-2010.xls, Kalibrace_2-28-11-2010.xls) naleznete výsledky. Z výsledků sestavte grafy, z nichž určíte efektivitu PCR jak pro každý gen zájmu, tak pro referenční gen ve směsi s genem zájmu.