Volné radikály ve fyziologii živočichů RNDr. Milan Cíž, Ph.D. RNDr. Antonín Lojek, CSc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D. Laboratoř patofyziologie volných radikálů Biofyzikálni ústav Akademie věd ČR Volné radikály ve fyziologii živočichů 1. Chemie volných radikálů, historie kyslíku na Zemi 2. Zdroje a tvorba volných radikálů 3. Antioxidační obranné mechanismy 4. Oxid dusnatý - tvorba a funkce 5. Fagocyty, myeloperoxidasa, NADPH oxidasy 6. Volné radikály ve fyziologických regulacích 7. Oxidativní poškození biologicky důležitých molekul 8. Volné radikály a ateroskleróza 9. Úloha volných radikálů u vybraných nemocí 10. Volné radikály a stárnutí 11. Metody stanovení oxidativního stresu 12. Seminář Doporučená literatura Štípek S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing, Avicenum, 2000. Ďuračková Z. a kol.: Voľné radikály a antioxidanty v medicíne (1, 2). SAV Bratislava, 1998-1999. Halliwell B., Gutteridge J.M.C.: Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, 1999. Gutteridge J.M.C., Halliwell B.: Antioxidants in nutrition, health, and disease. Oxford University Press, 1995. Doporučená literatura Free Radical Biology and Medicine Free Radical Research Redox Report Nitric Oxide Antioxidants and Redox Signalling Koloběh kyslíku Q zásoby (mol) O toky (mol/rok) 6,0 x 1017 O2 Fosilní paliva Fotolýza vody 7 x 109 Historie kyslíku na Zemi 3,5 mld 2,5 mld 1,3 mld 500 mil 5 mil intenzivní sluneční záření > chemie volných radikálů > první složité organické molekuly > anaerobní život modrozelené řasy: 2H20 —> 4H + 02 hladina O2 v atmosféře: 1% primitivní anaerobní organismy mizí, objevují se Eucaryota (rostliny, živočichové) hladina O2 v atmosféře: 10% > ozonová vrtsva > suchozemské formy života hladina O2 v atmosféře: 21%, objevil se člověk Adaptace organismů na kyslík první zive organismy Anaerobní Adaptace Zánik Únik do anaerobního prostředí Adaptace organismů na kyslík • enzymy využívající kyslík a transportní řetězce elektronů • účinnější oxidace složek potravy, vytvářející více energie na jednotku hmoty potravy • antioxidační obranné mechanismy Dýchání a fotosyntéza glykolýza a respirace C6H12O6 + 6 O2 <- 6 CO2 + 6 H2O fotosyntéza Dýchání a fotosyntéza Ghioropiast Thylakoidy Fotosyntéza Mitochondrie Vnější membrána NADH NAD+ 2e- Dýchací řetězec NADH-koenzym Q reduktáza Cytochrom C i Cytochrom oxidáza Ubiquinon (oxidovaný) 1e- Semiquinon (část. redukovaný) 1e- Ubiquinol (plně redukovaný) KoQH2-cyt. C + reduktáza O2 2H2O Antioxidační obranné mechanismy Antioxidant = jakákoliv látka, která oddaluje nebo inhibuje oxidativní poškození cílové molekuly Látka, označovaná jako antioxidant by měla splňovat následující kritéria: - musí mít schopnost reagovat s biologicky odpovídajícími oxidanty a radikály - produkt odvozený z její reakce s radikálem musí být fyziologicky méně nebezpečný než odstraněný radikál - musí být přítomna v dostatečně vysoké koncentraci alespoň v určitých tkáních, aby mohla zajistit kvantitativně odpovídající úroveň reakce Antioxidační obranné mechanismy Primární antioxidanty: Prevence tvorby volných radikálů Sekundární antioxidanty: Vychytávání a odstranění vytvořených volných radikálů Terciární antioxidanty: Náprava oxidativního poškození makromolekul Primární antioxidanty Pevence tvorby volných radikálů: • Vyvázání iontů přechodných kovů • Regulace aktivity enzymů Sekundární antioxidanty • Kompartmentalizace volných radikálů • Vychytávače volných radikálů - Antioxidační enzymy (SOD, kataláza, glutathion peroxidáza a glutathion reduktáza) - Nízkomolekulární antioxidanty (glutathion, kys. močová, vitaminy, apod.) Terciární antioxidanty Oprava oxidačního poškození • DNA - glykosylázy specifické pro určité oxidované báze - nespecifické excision opravné enzymy • Proteiny - proteolytické enzymy • Lipidové hydroperoxidy - glutathion peroxidáza Co je volný radikál? • nepárový elektron ve vnějších valenčních orbitalech • lichý počet elektronů • relativně vysoká reaktivita Jak značíme volný radikál? ho ~ ho- Jak značíme volný radikál? volný radikál anion o2- molekula Reaktivní formy kyslíku a dusíku Volné radikály Látky neradikálové povahy Reaktivní formy kyslíku Superoxid Peroxid vodíku H2O2 Hydroxylový radikál HO» Kyselina chlorná HOCl Alkoxylový radikál RO» Ozon O3 Peroxylový radikál ROO» Singletový kyslík Reaktivní formy dusíku Oxid dusnatý NO» Peroxynitrit ONOO- Oxid dusičitý Dusitany NO2- Dusičnany NO3- Nitrosyl Reaktivní formy kyslíku 02 —^> 02- H202 OH OH- z z 2H+ z z _0H. Reaktivní formy kyslíku Molekulární kyslík - 3£O2 a*2p TT*2p n 2p a 2p a*2s a 2s [He] Singletový kyslík - 12O2 a*2p TT*2p Tr2p a2p a*2s a2s [He] Odhadované poločasy rozpadu volných radikálů v biologických systémech Reaktivní metabolit kyslíku (dusíku) t1/2 [sec] Hydroxylový radikál HO- 10-9 Alkoxylový radikál RO* 10-6 Peroxylový radikál ROO* Oxid dusnatý NO* 1 - 10 Peroxynitrit ONOO- 0,05 - 1 Redukční potenciály některých RMK Oxidovaná/redukovaná forma Redukční potenciál (V) H2O / hydratovaný elektron -2,84 O2, H+ / HO2* -0,46 Fe3+ -transferrin / Fe 2+ -0,40 -0,33 NAD+, H+ / NADH -0,32 Fe3+ -ferritin / Fe 2+ -0,19 Ubiquinone / Ubisemiquinone -0,04 H2O2,H+, / H2O, HO* 0,32 O^-, 2H+ / H2O2 0,94 ROO*, H+ / ROOH 0,77 - 1,44 RO*, H+ / ROH 1,60 HO*, H+ / H2O 2,31 Redukční potenciály některých RMD Oxidovaná/redukovaná forma Redukční potenciál (V) NO* / NO- 0,39 NO2* / NO2- 0,99 NO+ / NO* 1,21 NO2+ / NO2* 1,60 ONOOH / NO2* 2,10 HO*, H+ / H2O 2,31 Vznik a zánik radikálů Oxidace Redukce Homolytické štěpení kovalentní vazby záření (např. UV) mikrovlnné záření ultrazvuk? Oxidace vs. redukce Oxidace nabytí kyslíku C + 02 =^> C02 ztráta elektronu 02*~ =^> 02 + e~ Redukce ztráta kyslíku C02 + C ^> 2CO nabytí vodíku C + 2H2 ^> CH4 nabytí elektronu 02 + e" =^> 02*~ Oxidační činidlo: oxiduje jinou látku (odebírá jí elektron, odebírá vodík, nebo poskytuje kyslík) Redukční činidlo: redukuje jinou látku (poskytuje jí elektron, vodík, nebo odebírá kyslík) Ionty přechodných kovů a volné radikály Haber - Weissova reakce: H2O2 + O2'- -► O2 + HO- + HO' Přechodnými kovy katalyzovaná Haber - Weissova reakce: -► O2 + Fe2+ -► Fe3+ + HO- + HO' (Fentonova reakce) O2'- + Fe3+ Fe2+ + H2O2 - Fe2+ + ROOH ► Fe3+ + HO- + RO' Dismutace ROS 2O2'- + 2H+- H2O2 + O2 H2O2 + Cl-- H2O + OCl' H2O2 + OCl' - H2O2 + Cl' + 1O2 O2'- + O2'- + 2H+ —► H2O2 + 1O2 O2'- + NO'- ONOO- ONOO- + H+- ONOOH ONOOH - HO' + NO2' H2O2 + ONOO- - —► 1O2 + NO2' + H2O Reaktivita ROS • Iniciace • Propagace • Terminace Rt + e--> • Rx • • • .Ri + R2->R1 + .R2 •R2 + R3-> R2 + R3 •R3 + R4-> R3 + R4 • • • •R + R-> R-R Patofyziologie volných radikálů FYZIOL. FUNKCE ZDROJ POŠKOZENI oxidace xenobiotik Energie regulace hladkého + svalstva destrukce patogenů Cyt. P-450 Mitochondrie Endotel. buňky Fagocyty DNA proteiny lipidy sacharidy Oxidativní stres Prooxidanty Antioxidanty