Poškození biologicky důležitých makromolekul ca Poškození Následky nenasycené mastné kyseliny v lipidech ztráta dvojných vazeb, tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy) změněná fluidita lipidů, změny v propustnosti membrán, vliv na membránově vázané enzymy, tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy proteiny agregace a síťování, fragmentace a štěpení, modifikace thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin, reakce s hemovým železem změny v transportu iontů, vstup Ca2+do cytosolu, změny v aktivitě enzymů DNA štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce, křížové vazby řetězců mutace, translační chyby, inhibice proteosyntézy Poškození DNA NH7 O O OH OH H I - adenin II- guanin III - cytosin IV - uracil (pouze v RNA) V - thymin (pouze v DNA) VI - D-ribóza (pouze v RNA) VII - 2-deoxy-D-ribóza (pouze v DNA) Nukleosid - báze připojená k cukru Nukleotid - báze + cukr + fosfát DNA je stabilní molekulou, v průběhu času však dochází ke spontánním změnám Příklad spontánních změn: Ztráta purinů („apurinic sites") Cytosin může pomalu ztrácet aminoskupinu (deaminace) za vzniku uracilu Spontánní změny jsou opravovány reparačními mechanismy. Oxidativní stres silně akceleruje poškození DNA Poškození DNA po expozici: reaktivním metabolitům kyslíku a dusíku ionizujícímu záření zvýšené koncentraci kyslíku aktivovaným fagocytům cigaretovému kouři ozonu xanthin oxidase DNA je poškozována reaktivními metabolity kyslíku i dusíku. Hydroxylový radikál - vysoce účinný a neselektivní: 1. reaguje s deoxyribózou (vyjmutí vodíku) - vzniká malondialdehyd a další produkty Důsledky - destrukce sacharidu a přerušení řetězce . To vede k aktivaci PARP (poly(ADP-ribose)polymerasa - enzymu vázaného na chromatin, který využívá NAD+ knápravě zlomů). Nadměrná aktivace PARP = deplece NAD+ = interference se syntézou ATP = buněčná smrt. 2. připojuje se k purinovým a pyrimidinovým bázím - mění je na hydroxyderiváty a oxoderiváty Důsledek - chybné párování bází při replikaci DNA a zavedení chyby do genetické informace Singletový kyslík -negeneruje řetězcové zlomy, reaguje hlavne s guaninem Produkty LPO (RO*, ROO*) mohou poškozovat DNA Reaktivní metabolity dusíku mohou působit nitraci nebo deaminaci bází DNA Důsledky oxidativního poškození Modifikace bazí vedou k mutacím. Příklad: RNS deaminují A na HX, C na U a G na X, což má za následek nesprávné párováni bází (např. správné párování A - T je nahrazeno HX - C ) Excisní reparace Oxidované, deaminované nebo špatně spárované (mismatch) báze jsou odstraňovány podobným mechanismem. První typ = nukleotidová excisní reparace Chybný nukleotid je vystřiž en nukle asou DNA polymerasa naváže správné nukleotidy podle neporušeného řetězce Následně DNA ligasa řetězec uzavře. Druhý typ = excizní reparace báze DNA glykosylasa hydrolyzuje vazbu abnormální báze na cukr-fosfátovou kostru Tím vzniká„APsite" (apurinic or apyrimidinic site) Dále je uvolněna AP-deoxyribóza působením AP lyasy na 3' a AP endonukleasy na 5' konci DNA polymerasa zaplní jednonukleotidovou mezeru DNA ligasa uzavře řetězec DNA Reparace dvouřetězcových zlomů Vznikají působením ionizujícího záření (tvorba OH*) Náprava je možná, ale je daleko těžší než u jednořetězcových zlomů, protože neexistuje intaktní řetězec. Nesprávné reparace vedou k velkým abnormalitám DNA známým jako chromozomové aberace. Poškození lipidů Peroxidace lipidů Tuky a oleje při skladování na vzduchu žluknou (autooxidační radikálová řetězová reakce) V biologických systémech tomuto procesu podléhají PUFAs, tj. polynenasycené mastné kyseliny s více dvojnými vazbami Tři fáze lipidové peroxidace První fáze = iniciace Hydroxylový radikál HO*, alkoxylový radikál RO* a peroxylový radikál ROO* Každá ztěchto látek dokáže vytrhnout vodík z metylenové skupiny řetězce mastné kyseliny. Mastná kyselina nebo lipid se tak stává uhlíkovým radikálem (-*CH-) LH + HO* L* + H2O Druhá fáze = propagace Po vytržení vodíku se elektrony v uhlovodíko vém řetězci mastných kyselin uspořádají tak, že mezi dvěma dvojnými vazbami je j edna vazba jednoduchá (= konjugovaný dien). Tyto látky reagují s molekulárním kyslíkem za vzniku peroxylového radikálu (LOO*) L* + O2 LOO* LOO* je schopen vytrhnout elektron z mastné kyseliny sousedního lipidu, která se tak stává novým radikálem, zatímco LOO* se přemění na hydroperoxid (LOOH). LH + LOO* L* + LOOH Třetí fáze = terminace Radikálová reakce se v lipidech propaguje, dokud se radikál PUFA nesetká s jiným radikálem nebo s vitamínem E, kdy se řetězová reakce ukončí vznikem stabilní sloučeniny (terminace). Výsledkem lipidové peroxidace jsou: Hydroperoxidy mastných kyselin Cyklické endoperoxidy mastných kyselin Tyto peroxidy jsou poměrně stabilní, dokud se nesetkají s tranzitními prvky, které katalyzují Fentonovu reakci. V ní se lipidové peroxidy mění na alkoxylové radikály LO* a hydroxidový anion OH -. LOOH + Fe (II) [nebo Cu (I)] LO* + Fe (III) [nebo Cu (II)] + OH - fosfolipid odejmutí vodíku (elektron + proton) LH alkylový radikál přeuspořádání molekuly konjugovaný dien alkylového radikálu R1 příjem kyslíku peroxylový radikál R1 cyklizace L* 0—0 LOO R2 LOOH 0 hydroperoxid 1 H O O Lo fy malondialdehyd -štěpení komplex Fe(ll) alkoxylový radikál alkenylový Ri: (nebo alkanylový) radikál RH komplex Fe(lll) ° peroxylový radikál o* alkanaly alkenaly (4-HNE, M DA) modifikace biomolekul alkeny alkany plíce V organismu probíhá: Neenzymová LPO Probíhá popsaným způsobem - reakcí s volnými radikály. Dává směs různých produktů: Etan, pentan - vydechujeme plicemi malondialdehyd (MDA), 4-hydroxynonenal (HNE) se navazují na proteiny a mění jejich životnost a funkci. Enzymová LPO Probíhá na aktivních centrech hydroperoxidáz a endoperoxidáz (cyklooxygenáza, lipoxygenáza) a produkuje biologicky aktivní látky důl ežité v řízení biologických dějů. Volné radikály nejsou v tomto případě uvolňovány z enzymu, a tak ne škodí. kUACHlBONlC AClD METABOLISM AA* 5l8l -eioD$atetmenoio.alt'f}2$c! peroxidase /yzm-(, 0~rad. if PflOSVHOUPllB lonaphcres rne- ' IA dlectneat VLA strongest chemoMiractant % °+ gh'mu \aies neutroph ■ h proctu c'l-nLt/ifte ike St/n-lhesfiz of py0h&,'n „ > ihkc&i'Aons of VIA. * ^ /'^-(leukocytes —mosi Stimulated by lipo- wfrt; yupttr -———-- Cne-S CfStimuJ- /. , I ' ' faas/cells y- oroncbosp^&m \n slerqies uloe & ' a --1—-ft. • , QfDrtu/oe.& \ . . 'ih ihe. lungs 3 ,i , 0*i«r^ ^»4^ * >&«Pt!T**i^*er-urn? U HP x ins ■3, Js-cL-i-itrE lnacroirJ-/nj , Anef&er pkospko - -p-^otnop^^ somite. irth',bvj' 3/ aifoi'n'n ^^til^w tux***. »hydroper-oxus endope.rojc,e{e 0 4~>l O ii ■pHflSPfyoTiDyz- /N OS/TO L. pen pera VaSotor>5'i) ^ Vase. endows/ . . . muscle relaxzlyoh rh±2. ,nhibi*s platelet ogoZl inc redses PROSTACYCLIN PhospholfpaseC (see also "receptor-/.gaud" mteraoh. m^o^jjf 2- Spent. Cholesterol Protein molecule (extrinsic) Phospholipid moiccuíes Protein molecules (intrinsic; O Fatty acid Fatty acid CH,—O I " O—CH GLYCEROL CH2—PO4—Base Fig- 4,e. The Fig. 2- Chain reaction of vitamin E with lipid radicals and vilamin C. Mechanisms of damage to cellular targets by oxidative stress: lipid peroxidation 289 Table 4.9. Some common, naturally occurring fatty acids Shorthand name" Common name Examples of occurrence 16:0 Palmitic 18:0 Stearic 18:1 (n- -9)b Oleic 18:2 (n- -6) Linoleic 18:3 (n- -3) a-linolenic 20:4 (n- -6) Arachidonic 20:5 (n- -3) Eicosapentaenoic 22:6 (n- -3) Docosahexaenoic' Natural fats and oils, especially palm oil Natural fats and oils, especially beef fat Natural fats and oils, especially olive oil Widespread, many seed oils All plant leaves, some seed oils, e.g. soybean, rapeseed, linseed oils Animal membranes Fish oils Fish oils, nervous system 'Number of carbons in chain : number of double bonds. ''The numbering system in parentheses (often used in the nutritional literature) identifies double bonds from the methyl, —CH3, end of the chain. For other nomenclature see Fig. 4.14. ' Docosahexaenoic acid is particularly important in the mammalian brain and in the retina of the eye. Často diskutovaná otázka Jsou prospěšnější nasycené nebo nenasycené mastné kyseliny ? Není jasná odpověď. Jsou prospěšnější n = 3 nebo n = 6 mastné kyseliny ? Grónští Eskymáci - velmi nízká frekvence srdečníc h onemocnění, psoriázy, sklerózy multiplex - předpoklad, že je to způsobeno n = 3 mastnými kyselinami v rybím tuku. Studie s podáváním rybího tuku jako protektiva nebo léčiva nejsou přesvědčivé. Možný důvod: n = 3 mastné kyseliny v rybím tuku peroxidují velmi ochotně (vždy 2030% prodávaného rybího tuku je peroxidováno) . Poškození cukrů a proteinů Glykace a glykooxidace Glukóza v roztoku existuje v nealdehydické kruhové formě, částečně však i v rovném řetězci tvořícím aldehyd. Aldehydy jsou chemicky reaktivní a mohou se vázat na aminoskupiny proteinů v procesu nazývaném neenzymatická glykace. Vzniká tzv. Schiffova báze. Zvýšená hladina glukózy v krvi vede k patologické hladině glykace. Po určité době se Schiffovy báze přeuspořádávají. Vzniká Amadoriho produkt. Amadoriho produkt se dále během týdnů až měsíců mění na konečné produkty pokročilé glykace = Maillardovy sloučeniny neboli advanced glycation end products (AGE). AGE se mohou oxidovat kyslíkem za vzniku superoxidu a tudíž i dalších ROS. (Karboxymethyllysin a pentosidin jsou typické produkty oxidace AGEs). Glykaci tedy provází glykooxidace a oxidační stres. glycation O, Glycated protein Glucose oxidation AGEs oxidation Reactive dicarbonyls protein www Lysine vww/v O AAAMA NH -CH-C AAAAAA I (CH2)4 NH I CH2 COOH Carboxymethyl-lysine Fig. 9.11. Glyoxidation reactions. The combination of glycation and oxidation can result in the formation of advanced glycosylation end-products (AGEs) whose increased accumulation appears associated with tissue injury in diabetes mellitus. Glucose can be oxidized before binding to proteins, or glycated proteins can themselves oxidize releasing ROS. Carboxymethyllysine (N6) and pentosidine have been identified as glycoxidation-derived constituents of AGEs, but there are many others. Fig. 9.9 shows formation of A/£-carboxymethyllysine from an Amadori product. www Arginine www Pentosidine Glykace mění vlastnosti modifikovaných proteinů Příklady negativního působení glykace: inaktivace SOD = zvýšený oxidativní stres glykace apoB v LDL = změna náboje LDL částice a její vazba na scavenger LDL receptory makro fágů AGE jsou rozeznávány specifickými receptory na povrchu cévních a imunitních buněk a následně ovlivňují transkriční faktory a expresi genů cílových buněk AGE zvyšují syntézu adhezivních molekul na cévní stěně. Podporují adhezivitu monocytů a jejich průnik do cévní stěny. Tím podporují vznik aterosklerózy. Proteiny = významný cíl volných radikálů Řada aminokyselin je hydroxylována hydroxylovým radikálem a nitrována peroxynitritem (tryptofan, fenylalanin, tyrosin) S proteiny reagují rovněž alkoxylové a peroxylové radikály vznikající při LPO OH* r?rr/iö-Tyrosine Phenylalanine RNS OH' N OH meta-Tyrosine N02 3-Nitrophenylalanine OH Tyrosine OH* HOC1 ,RNS OH OH DOPA CI O' O NO. OH OH 3-Chlorotyrosine 3-Nitrotyrosine COOH I H2N-C-H J H Histidine COOH I H2N-C-H ™_. tri H 2-Oxohistidine Figure 4.27(a) R R Tyrosyl radical OH OH R R Bityrosine + other products cocr I + H—C— NH. I 0,N ^ N coo" 2 h 1 + H —C—NH, 6-Nitrotryptophan -CH Tryptophan CO—CH9—CH cc ^^^NHCHO COOH NH. N-Formy 1 kynuren ine 7T H20 HCOOH NH. I COCH^-CH-COOH NH- Kynurenine COOH I H.N-C—H 2 I CH. I 2 CH. I 2 S I CH3 Methionine ros COOH I H.N-C-H 2 I CH. I 2 CH. I 2 s=o I CH3 Sulphoxide COOH I H.N—C-H 2 I CH. I 2 CH. I 2 o=s=o I CH3 Sulphone NH-CH-CO-R I CH. I 2 CH. I 2 CH. I 2 NH R.-NH-CH-CO-R C= I NH NH Oxidation ->■ Arginine Rj-N-CH-CO-R, Proline Oxidation ->- Rj-N-CH-CO-R, HO NH-CH-CO-R. I CH. I 2 CH. I 2 H-C = 0 Glutamyl semialdehyde Figure 4.27. Some specific end-products of oxidative damage to amino-acid residues in proteins. Only selected products are shown; many others are known. Důsledky poškození proteinů Změna enzymatické aktivity Změna iontové homeostáze buňky (porucha fukce transportních pump) V cytosolu se hromadí Ca2+ -> aktivace proteáz a fosfolipáz Vznik nových antigenních determiannt a nástup autoimunitních reakcí Změny v molekulární buněčné signalizaci 342 Oxidative stress: adaptation, damage, repair and death Oxidative sllCss DNA .1.1111 -if ^7 Poly synthetase JlKXl NAD (HJ depletion CSH depletion Inhibition of ATP synthesis Kim-- in intracellular free iron/coppei Direct damage GSH depletion 1 L Rises in intracellular free Ca:' Cyioskelctal damage Increased lipid pern* idat ion Activation of NOS Membrane blcbtxnn Peroxynitnte formation Membrane peroxidation and destruclion I t Int.leased damage to DNA proteins, lipids Mcial H