Oxid dusnatý Antonín Lojek Kromě mnoha literárních pramenů byla k přípravě použita také přednáška Dr. Hampla - FN Motol. (http://physiology.li2.cuni.cz/hampl/teach_slides/no_slides/index.htm) Oxid dusnatý ( = nitric oxide = NO) NO je molekulou složenou z 1 atomu kyslíku a 1 atomu dusíku Tyto atomy jsou vázány dvojnou vazbou Na atomu kyslíku se nacházejí 2 páry elektronů (nevazebných) Na atomu dusíku se nachází 1 pár nevazebných elektronů a jeden elektron nepárový Molecular formula NO Structural formula N = 0 Molecular models Space filling Ball-and-stick NITRIC OXIDE Nitric oxide (NO), a colorless gas that turns brown when it contacts air, is a known pollutant and component of cigarette smoke an d automobile exhaust. But in the bo dy, NO is a chemical mes senger with a ro le in the relaxation of smooth muscle cells. Atmospheric Nitrogen Oxides Oxid dusnatý • ještě před pár lety pouze nepříjemné a nebezpečné znečištění ovzduší přispívající ke smogu a kyselým dešťům, dnes nejstudovanější endogenní molekula posledních 20 let • explozivní rozvoj znalostí (cca 300 nových publikací měsíčně) • nové téma, ve starších učebnicích chybí • "Molekula roku" 1992 prestižního vědeckého časopisu Science • účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů • během několika let postup od základního objevu k významným klin ickým pokrokům (PPHN, ARDS, šok, impotence) Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn http://www.persistent-pulmonary-hypertension-newborn.com/ Persistent pulmonary hypertension of the newborn (PPHN) occurs when a newborn's circulation system does not adapt to breathing outside the womb. While a fetus is in the womb, it gets its oxygen from its mother's placenta through the umbil ical cords, so the lun gs need little blood supply. In PPHN the newborn's arteries to the lungs remain constricted after delivery, limiting the amount of blood flow to the lungs and therefore the amount of oxygen into the bloodstream. Acute respiratory distress syndrome http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_respiratory_distress_syndrome Acute respiratory distress syndrome (ARDS), also known as respiratory distress syndro me (RDS) or adult respiratory d istress syndrome (in co ntrast with IRDS) is a serious reaction to various forms of injurie s to the lung. ARDS is a severe lung disease caused by a variety of direct and indirect issues. It is characterized by inflammation of the lung parenchyma leading to imp aired gas exchange with concomitant systemic release of inflammatory mediators causing inflammation, hypoxemia and frequently resulting in multiple organ failure. This condition is often lethal , usually requiring mechanical ventilation and admiss ion to an intensive care unit. HISTORIE 1620 - NO prvně připraven Belgičanem Janem Baptistou van Helmontem (t.j. dříve než třeba kyslík - 1774) 1772 - chemicky charakte rizován Josephem Priestleyem (objevitel kyslíku) 1800 - toxicita (Sir Humphry Davy se málem zahubil, když to zkoušel dýchat) 1867 - amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, žeto dělá tím, že uvolňuje N O) 1914-1918 - dělníci plnící za první světové války nitroglycerin do dělostřeleckých granátů mě li velmi nízký krevní tlak, což vedlo k zavedení nitroglycerinových tablet pro ú levu při angině pectoris; dnes víme, žeúčinek amylnitritu i nitroglycerinu je zprostředkován oxidem dusnatým uvolňovaným z těchto látek 1977 - NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci cGMP (Ferid Murad) 1980 - objev endoteliálního relaxačního faktoru (EDRF, Robert Furchgott). S naha i dentifikovat EDRF vedla bezprostředně k objevu, že EDRF = NO 1987 - schopnost eukaryotických buněktvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Mo ncada 1998 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství: Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad ("za klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systém u") (Moncada cenu nedostal, přestože to mnozí čekali) (Alfred Nobel vydělal na Nobelovy ceny tím, že vynalezl dynamit, založený na nitroglycerinu, s ám trpělICHS,předepsali mu nitroglycerin, Nobel to považoval za ir onické) Robert F Furchgott 1916 Dept. of Pharmacology, SUNY Health Science Center New York Louis J Ignarro, Ferid Murad 1941 1936 Dept. of Molecular and Med ical Dept. of Integrative Biology Pharmacology Pharmacology and Physiology UCLA School of Medicine University of Texas Medical Los Angeles School, Houston Furchgottův Sandwich Furchgott prokázal, že relaxace cév indukovaná acetylcholinem je závislá na endoteliu. Použil dva kousky aorty, u jednoho odstranil epitelium Acetylcholine (http://en.wikipedia.org/wiki/Acetylcholine) Acetylcholine has functions both in the peripheral nervous system (PNS) and in the central nervous system (CNS) as a neuromodulator. In the PNS, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. In the CNS, acetylcholine and the associated neurons form a neurotransmitter system, the cholinergic system, wh ich tends to cause excit atory actions. In PNS In the peripheral nervous system, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. . When acetylcholine binds to acetylcholine receptors on skeletal muscle fibers, it opens ligand gated sodium channels in the cell membrane. Sodium ions then enter the muscle cell, stimulating muscle contraction. A cetylcholine, while inducing contr action of skeletal muscles, instead induces decreased contraction in cardiac muscle fibers. This distinction is attributed to differences in receptor structure between skeletal and cardi ac fibers. Ignarrova spektrální analýza Ignarro pomocí spektrální analýzy prokázal, že EDRF je totožný s NO. Hemoglobin (žlutý) exponovaný endoteliálním buňkám produkujícím EDRF (konverze oxyhemoglobinu na methemoglobin) 1 Hemoglobin (žlutý) exponovaný přímo NO Posun v absorbční křívce je identický (EDRF = NO) Muradova enzymatická aktivace Murad věděl, že nitroglycerin působí relaxaci hladké svaloviny. Enzym guanylát cyklasa byla aktivována a indukovala zvýšení cGMP s následnou relaxací svalu. Působí nitroglycerin cestou uvolňování NO ??? Probublával NO přes tkáň obsahující enzym - cGMP se zvyšoval. NO avidly binds to the heme moiety of hemoglobin (in red blood cells) and the heme mo iety of the enzyme guanylyl cyclase This enzyme catalyzes the dephosphorylation of GTP to cGMP, which serves as a second messenger for many important ce llu lar functions, particularly for signalling smooth muscle relaxation. Cyclic GMP induces smooth muscle relaxation by multiple mechanisms including increased intracellular cGMP, which inhibits calcium entry into the cell , and dec reases intracellular calcium concentrations (click here for details) activates K+ channels, which leads to hyperpolar ization and relaxation stimulates a cGMP-dependent protein kinase that activates myosin light chain phosphatase, the enzyme that dephosphorylates myosin light chains, which leads to smooth muscle relaxation. Něco málo chemie o NO • NO je radikál (lichý počet valenčních elektronů, konkrétně 11 - o 1 víc než N2, o 1 míň než O2) • to, že je to radikál, se někdy zdůrazňuje tečkou (NO), to ale není nutné, "radikálovost" je implicitní v označení NO •z N2 a O2 se tvoří jen za specifických podmínek při vysokých tepl otách, např. při blesku; taky vzniká ve spalovacích motorech a tepelných elektrárnách • samovolně se nerozkládá, jen za vyššího tlaku - při něm pozvolna vzniká 2-3 % toxického NO2 za měsíc (pozor na skladování v bombách!) • poměrně málo rozpustný ve vodě (~1.7 mmol/l při 25oC), t.j. řádově pod obně jako O2 či N2 • v přítomnosti kyslíku podléhá autooxidaci za vzniku N02: 2 NO + 02 2 NO2 • autooxidace je asi 200x rychlejší v roztoku než v plynné fázi • autooxidace je rychlá (několik sec), je-li NO i O2 hodně, ale celkem pomalá, je-li NO málo - jako je tomu většinou v tkáních, kde je NO méně než 10 uM (poločas NO tam může být až 500 sec) • ve vodném roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (NO2-), pou ze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO3-) • v přítomnosti superoxidu vzniká extrémně rychle peroxynitrit: NO + O2- -- > -OONO -OONO není radikál, ale je velmi reaktivní a cytotoxický • NO je velmi rychle inaktivován oxidací s železem oxy hemoglobinu za vzniku NO3- V savčích buňkách je NO tvořen oxidací terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem; kromě NO vzniká L-citrulin L-arg + O2 > NO + L-cit H ©1 NH NU o, —^ f 0.5NADPH ^ L H20 N=0 L-Arfiinirw HjN TOO H^-Hydroxy-L-Anifnine e © L-Citrulline e Nitric Celou komplexní reakci katalyzuje jediný enzym, NO syntáza, která existuje ve 3 isoformách Nitric oxide L-Arginine + 02 + NADPH Nitric Oxide I Jhiol fad jmnthdB Synthase ý Citrulline + NO + NADP I Guanylate cyclase GTP cGMP Syntásy oxidu dusnatého • neuronální syntása oxidu dusnatého (NOS1 = nNGS) • inducibilní syntása oxidu dusnatého (NOS2 = iNOS) • endothelials syntása oxidu dusnatého (NOS3 - eNOS) Každá z těchto syntáz: • má rozdílnou tkáňovou distribuci • lokalizovaná na různých chromozomech r i Name L J r i Present in L J Stimuli i i [ Description NwuíTJiiil NOS (nNQS or HD&1 Centra1 and peripheral neurons, platelets, pencreatc (1 cella, aplhelial calls MWDA, insuln, thrnmbir Produces HO m neuronal tissue In bah rr a cenu ol and peripheral nerjtjus system. Neuronal NOS alsc perfp^o a role in nil mnminiHtEn and PsassMialed inllh plasma rnflrnbranffs. nNOS action can oe inhibited oy NPA (N-propyl-l-arglnne). Inducible NOS (INOS ar NOS2I Macrophages, enůotheliel cella, Chondrocytes, nepíitocyteri. smojlh inusde cb Ife Enddcidn, IFN-v, 11. TNF-o Can be found in the uhhtj ne system out is also found in the caidiovascular system it u sec the oxidative stress of NO (a free radcal) b be used by macrophages in irnmune defence agamst pathogens. Endothelial NOS (eNOS or NOS J oř co-iclitut \d cNQEl Endothelial cella, neurons, cardiac myocytes A l-Vl h!ll h-ADP, thrombin, £f-e a' stress, Generates ND in bbed vesssls ajid is inucfoed nth regulating vasoJarfunction. A ccnsilutlva Ca^ i depflfidcl MOS provices a Cass ra'aaae of NO- alMCS ia assorted with plasma msrrDraries surround fig calls and the menbrartes oFGalgi undies within oels Všechny 3 isoformy NO syntázy: jsou aktivní jako homodimery obsahují v aktivním centru hem jsou stereospecifické (D-arginin není substrátem) jako kofaktory vyžadují: NADPH, 6 (R)-5,6,7,8 -tetrahydrobiopterin, FAD, FMN a kalmodulin (ten se k NOS typu I a III váže po navázání Ca na kalmodulin, NOS II váže kalmodulin trvale) ÚČINKY NO NA CÍLOVOU TKÁŇ • při velkých množstvích obvykle převládá oxidace (O2, O2-) za tvorby vysoce reaktivních, cytotoxických produktů (ONOO-) - zabíjení i jinak obtížně zlikvidovatelných baktérií (např. Mycob acterium tuberculosis), hub, parasitů a tumorů, inhibice replikace virů • v nižších koncentracích je oxidace pomalá, většinou převládá regulační působení prostřednictvím aktivace solubilní isoformy enzymu guanylát cyklázy (heterodimer obsahující hem, s kterým právě NO interaguje) • aktivace guanylát cyklázy zvyšuje v cílové buňce koncentraci cyk lického g uanosin-3',5'-monofosfátu (cGMP), ten zprostředkuje účinky NO cGMP: - snižuje intracelulární koncentraci Ca2+, v hladkém svalu přímo inhibuje kontr aktilní aparát - cGMP je inaktivován cGMP- fosfodiesterázami na 5'-GMP (selektivním inhi bitorem PDE V je třeba Viagra) FYZIOLOGIE NO • Neurotransmitter -učení, paměť, spánek, bolest, deprese • Zabíjí viry, baktérie, parazity, tumory (iNOS; indukci inhibují kortokosteroidy) • Inhibuje mitochondriální respiraci • Vazodilatace závislá na endotel u (ACh, eNOS) • Nejvíc NO se dělá v nose a paranasálních dutinách -Pravděpodobně důležité pro jejich dezinfekc i -NOlzedobřeměřit ve vydechovaném vzduchu -Maláčást vydechovaného NO pochází z dolních dýchacích cest (lze měřit odebíráním vzorků z úst) - mění se přiněkterý ch nemocech, např. astma) Příklad: koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu zdravých lidí. Hodnoty jsou nejvyšší při odebírání vzorků z nosu a podstatně nižší v ústech a distáln ějších úsecích dý chacích cest. V periferní průdušce je koncentrace NO pod detekč ním limitem vysoce citlivé chemiluminiscenční metody (Chest 110: 930-938; 1996). NO sensitizuje presynaptický neuron k silnějšímu signálu. To následně vede k s ilnější odpovědi postsynaptického neuronu. LppJd O lOMd B1 ion Mc-i br .no Damnen ONOO NOS L-CH * .l/J Bait Oamirje I CC PŕoiHifihOMUlflf illon tGMP V3sodimiion —*■ Biood Fín* CGMPtijiflfl íOMP- PKO l^nChininf) POE AfliVBli^n FarfcLjisoiťi Disease Pi opiiinimeíl Cell Den Iii Anil microbial Ageni ■ ■■ ■■■■ m HIVt" I FARMAKOLOGIE NO • Donory NO (nitroglycerin, nitropmsid, NOáty) • Inhibitory NOS (L-NMMA, L-NAME, aminoguadinin, asymetrický dimethylarginin) • Aktivátory eNOS (endotel-dependentní vazodilatancia) • Inhibitory fosfodiesterázy (Zaprinast, Viagra [sildenafil],...) Detekce NO - cell-permeabilní fluorescenční indikátory (4,5- diaminofluorescein diacetate (DAF-2 DA) - celková koncentrace nitrátů/nitritů - aplikace NO donorů compounds, NO scavengerů, a guanylyl cyklásy - NOS aktivita v buněčných homogenátech měřením enzymatické konverze argininu na citrulin během tvorby NO -inhibitory NOS (L-NAME) - aplikace protilátek k isoformám NOS (imunocytochemie, imunoblotting) - exprese genu pro iNOS Bioimaging of Nitric Oxide Using Diaminofluoresceine-2 (DAF-2) Advantages: Sensitivity for NO (5 nM in vitro) with high temporal and spatial resolution. No cross-reactivity to N02-/N03- and ON 00- Kojima et a!., Biol.Pharm. Bull. (1997) Assay limitations: Possible interference by reducing agents and divalent cations, requires standardized illumination conditions Gas-phase chemiluminescence assay NO Detection by Gas Phase _Chemilum Inescence_ Detection Principle: NO is purged from an aqueous solution using an innert gas such as Ar or He and transferred to a mixing chamber where it reacts with Oj under reduced pressure. NO + Oj NO, NOa + Ths 117": emitted by axc-ited N02 upon returning to the ground state is measured by photon counting (frn&t-pmol). Not very useful when attempting to quantify NO in uNysiuluyiujil fluids Such as bttum, pl»m* Ct urine, Why? the nnilumin«Ge rice reaction ReacLion-chamber SampLt capillary counter Electrochemical detection Ag/AgCl Sensing WPI \ Element Membrane Schéma experimentu: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. RAW 264.7 vysadíme na kultivačnú misku a kultivujeme v DMEM médiu v inkubátore pri 5% CO2 a 37oC. Počet buniek stanovujeme pomocou Coulter Countru (Coulter®, Coulter Electronics LTD, England) Bunky o koncentrácii 1x106/800 |jl inkubujeme 60 min. v800jil MEM média. Následne do skúmaviek s adherovanými bunkami aplikujeme lipopolysacharid (LPS) 5ng/ml. Mikroskúmavku umiestnime do meracej komorky a snažíme sa umiestniť elektródu na dno, tesne až k povrchu buniek. Zapojíme elektródu a spustíme meranie. Po ukončení pokusu a odpojení elektródy odpipetujeme médium. V médiu následne pomocou Griessovej metódy spektrofotometricky stanovujeme koncentráciu nitritov (NO2-), ktoré sú jedným z koncových metabolitov NO. A - referenčná elektróda B - pracovná elektróda C - pomocná elektróda ABC RAW 264.7 (1x106) DMEM + 10% FBS (5% CO2, 37oC). MEM (NaHCO3, stále pH) Hrbac J, Gregor C, Machova M, Králova J, Bystron T, Ciz M, Lojek A. (2007) Nitric oxide sensor based on carbon fiber covered with nickel p orphyrin layer deposited using optimized electropolymerization procedure. Bioelectrochemistry. Sep 27; [Epub ahead of print] 10h-1-1-1-1-1-1 0 I0O 2M JOD -100 500 G(W Time/s Fig. 2. Carbon fiber sensor's rherformance at nanomolar NO concenlralions (CPA at S30 mV (vSh Ag/AgCI)) Eight additions of NO into aeraled PES, each resulting in 4 nM NO concentration, followed by response tor 20 nM NO are sriihWTi. A:'Ll-i |'Il-Lil-:lLii:l-iiL lIil- l-Il-lLi;:;L- ;.;::-Ll-;I ■■■.iLli poly-NiTMIIPP, electropoLymerized foom 0.4 mM KiTMlTPP by 100 cycles from 0 to 1200 mV (vs. Ag/AgCIX scan rate 100 mVte).