#6 Klíčové molekulární komponenty vývoje Buňka ve vyvíjejícím se embryu musí umět a vědět nejrůznější věci: •vědět kdo je, kde je, kým bude a co bude dalším krokem v jejím buněčném životě •buňka činí rozhodnutí na otázky typu jako: Dělit se? Diferencovat? A v co diferencovat? Migrovat? A kam? Zemřít? • • • Co poskytuje buňce tyto informace? •a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Transkripční faktory Signály z vnějšího prostředí ruka Notch TGF/BMP •TGF – transforming growth factor •BMP – bone morphogenetic protein • •patří do TGFb nadrodiny TGFb nadrodina má následující podrodiny: 1.TGFb1-3 2.BMPs – 20 různých ligandů 3.GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4.activin/inhibin/nodal Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny BMP_signaling_pathway TGF-BMP Inhibitory BMP faktorů, jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP: •noggin •chordin (Chd) •sklerostin chordin vs chordin vs Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu Role BMP inhibitorů v Spemannově organizátoru BMP_chordin in Speman organizer Klíčová role BMP inhibitorů produkovaných notochordem při indukci nervové ploténky neurulation+notochord notochord (= chorda) produkuje faktory, které specifikují ektoderm a vedou ke tvorbě nervové ploténky (neural plate). Jde zejména o následující faktory: noggin, chordin a follistatin (inhibitory BMP a aktivinu). Samotná produkce těchto BMP inhibitorů specifikuje anteriorní (přední) nervovou trubici, v kombinaci s FGF specifikuje posteriorní (zadní) nervovou trubici. Nodal pool inaktivního proproteinu Nodal and left-right assymetry mouse gastrulation AVE – anterior visceral endooderm Nodal and left-right assymetry In situ hybridization analysis show altered expression of left determinant genes in Megf8m/m embryos. Zhang Z et al. PNAS 2009;106:3219-3224 ©2009 by National Academy of Sciences In situ hybridization analysis show altered expression of left determinant genes in Megf8m/m embryos. (A and B) Nodal is expressed at the node (arrowhead) and in the left LPM (arrow) in 4 somite stage wild-type embryo (A). In Megf8m/m embryos, Nodal expression was preserved at the node (arrowhead), but absent in the LPM. (C and D) In wild-type embryos, Lefty1 and 2 are normally expressed in the floor plate (arrowhead) and left LPM (arrow), respectively (C), but, in Megf8m/m mutants, expression of both Lefty 1 and 2 are lost (D). (E and F) Cryptic expression in the node and LPM show no change in Megf8m/m mutants (F) vs. wild-type (E) embryos. (G–I). Wildtype embryos show Pitx2 expression in the left LPM (arrow in G), but this is either lost (H) or bilateral (arrowheads in I) in Megf8m/m mutant embryos. Pitx2 expression in the head mesenchyme is unchanged. (J and K). Gdf1 expression in the node and LPM is not affected in Megf8m/m (K) vs. wild-type (J) embryos. (A, B, E, and F) Dorsal view. (C, D, and G–J) Ventral view. WT, wild-type; left (L)–right (R) orientation indicated by double arrowheads. (Scale bar: 100 μm.)‏ Vytváření levopravé asymetrie těla - role cilií • asymetrická exprese genů jako lefty1, lefty2, nodal a pitx2 • nodální cilie (9+0, dynein → pohyblivé) během gastrulace vytváří svým rotačním pohybem tzv. nodální proud • narušená funkce cilií → vzniká až situs inversus (vnitřní orgány uspořádány obráceně podle střední osy těla) nebo situs ambiguus Yokoyama, 2004 cshperspect-SYM-a000802002 LR assymetry in GDF mutant Figure 2. Analysis of situs defects in Gdf1-/- mice. a, Gdf1 +/- and Gdf1 -/- newborn mice with stomachs (arrowheads) on the left and right sides, respectively. Ventral views of tissues from newborn Gdf1 +/- (b,d,f,h) and Gdf1 -/- (c,e,g,i) mice are shown. b,c, Reversal of the orientation of the abdominal organs in Gdf1 -/- mice. Note also the streak-like appearance of the spleen and the abnormally shaped medial lobe of the liver. H, heart; Lv, liver; St, stomach; Sp, spleen; AC, KIF3A/B knockout myši, iv mutanti (nodální proud není vytvářen → lefty exprimován bilaterálně) GDF1 mutanti Emerging functions of Nodal •promotes pluripotency of the epiblast in vivo and of ES cells in vitro •controls fate of cancer stem cells – eg. in pancreatic cancer, very promising treatment GDF8 (myostatin) post-7-57588-MyostatinDog2 bull myostatin man WT Gdf8-/- WT Gdf8-/- whippet Belgian blue Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Receptorové tyrosin kinázy (RTK) RTKs - simplified scheme of action Hlavní skupiny RTKs: •EGF (epidermal growth factor) receptor family •Insulin receptor family •PDGF (platelet-derived GF) receptor family •FGF (fibroblast GF) receptor family – přednáška č. 9 •VEGF (vascular endothelial GF) receptor family •HGF (hepatocyte GF) receptor family •Trk receptor family •Eph receptor family •RET receptor family • Schematická struktura jednotlivých receptorů RTK families transmembránová doména tyrosin-kinázová doména extracelulární domény vážící ligand Obecné schéma aktivace RTKs (zde na příkladu EGFR) EGFR signalling 1.ligand se specificky váže na receptor 2.receptor dimerizuje 3.tyrosin-kinázové domény se navzájem fosforylují 4.autofosforylace vede k navázání (recruitment) adaptérových proteinů (zde Grb2) 5.v závislosti na receptoru se aktivují „downstream“ signální dráhy – zde např. Ras/Raf1/MEK/MAPK kinázová dráha, 6.která vede k regulaci transkripce 7. Vybrané ligand:RTK receptorové systémy a jejich modelové funkce ve vývoji •VEGF/VEGFR •ephrin/Eph •PDGF •Trk family •FGF/FGFR – viz přednáška č. 9 • Vascular endothelial growth factors (VEGF) a jejich receptory (VEGFR) vegf_rec_ligands VEGF/VEGFR ve vývoji •reguluje vznik a vývoj cévní soustavy •hypoxie (=nedostatek kyslíku) indukuje HIF (hypoxia-induced factor), který reguluje produkci VEGF; viz přednáška č. 7. •VEGF je schopen regulovat vznik de novo cév v hypoxické části embrya •- podobný mechanismus se uplatňuje i při onkogenezi, kde VEGF podporuje prokrvení nádorů a tím podporuje jejich růst VEGF in angiogenesis Blood vessel formation and tumor angiogenesis. During development, VEGF induces differentiation and proliferation of endothelial cells from its progenitors (the hemangioblast and angioblast) to form a poorly differentiated primitive vascular plexus (vasculogenesis). Angiopoietin-1 (Ang-1) and other morphogens (e.g. Ephrins-Eph) induce remodeling of the vascular plexus into a hierarchically structured mature vascular system through endothelial cell sprouting, trimming differentiation and pericytes recruitment (angiogenesis). During tumor angiogenesis, angiopoietin-2 (Ang-2) destabilizes the vessel wall of mature vessels. Quiescent endothelial cells become sensitive to VEGF (or other angiogenic factors), proliferate and migrate to form new vessels. Bone marrow-derived endothelial cell progenitors are found in the peripheral blood and can recruit at sites of angiogenesis. VEGF2 VEGF1 Eph/ephrin komplex •ephrin – jsou membránově vázané ligandy (podobně jako ligandy Notch dráhy) •ephriny A – na membráně upevněny pomocí tzv. GPI kotvy •ephriny B – transmembránové ligandy, které samy jsou schopny signálovat do buňky •Eph/ephrin systém je zapojen zejména do „navigace“ buněk (např. buněk cév) či jejich částí (např. navádění axonů v nervové soustavě), a do „contact-mediated cell sorting“ ve vyvíjejícím se embryu. Jde o obecný mechanismus regulující migraci buněk. ephb4 Eph-ephrin repulsion Eph/ephrin - při „axon guidance“ tj. navádění jednotlivých axonů v nervovém systému - growth cone retraction Eph/ephrin Unique feature: reverse signalling – tj. nesignáluje jen receptor, ale i ligand Supporting Information Movie 2. Ephrin-B2 induces extremely rapid growth cone collapse and axon retraction in VT RGCs. Movie depicts VT growth cones treated with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). Supporting Information Movie 4. Inhibiting Rho kinase strongly diminishes axon retraction but does not affect growth cone collapse. Movie depicts VT growth cones pre-treated the Rho kinase inhibitor Y-27632 for 1 hour, followed by treatment with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). videa z Petros et al., Dev. Neurobiol. 2010 PDGF PDGF family vyvoj plic_anglais Trk (tropomyosine-related kinase) •tři receptory exprimované v nervovém systému – TrkA, TrkB a TrkC •specificky váží neurotrofické peptidy – NT3-5, BDNF=brain derived neurotrofic factor, NGF=neural growth factor TrkA Neurotrofní látky – podporují přežívání neuronů – a tak regulují vzájemné propojení nervových buněk (po lopatě – neuron, který není synapticky spojen s jiným zahyne) neurotrophin retrograde transport a | Neurotrophin signalling events initiated in developing axons signal retrogradely to neuronal cell bodies to inhibit intrinsic cell death pathways. These signalling events also influence transcriptional programs that are involved in cell survival, axon growth, synaptogenesis, metabolism and the establishment of neurotransmitter and neuropeptide phenotypes. b | The establishment of pre- and postganglionic synaptic contacts in sympathetic neurons is influenced by retrograde nerve growth factor (NGF)–TrkA signalling. A potential synaptogenic signal downstream of retrograde NGF–TrkA signalling is the neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF). BDNF regulates the formation and maintenance of presynaptic contacts by signalling trans-synaptically to TrkB receptors on preganglionic sympathetic neurons. c | Neurotrophin-dependent axon growth is supported by both local and retrograde signalling through the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalling pathways. Retrograde neurotrophin signalling also regulates axon growth and target innervation through the activation of transcriptional programs. TrkA/C systém determinuje synaptická spojení v periferním nervstvu TrkA-C scheme nociceptory (receptory bolesti) – jsou determinovány expresí TrkA a přežívají díky NGF v kůži proprioceptory (receptory polohy/napětí svalu) – jsou determinovány expresí TrkC a přežívají díky NT3 ve svalu HGF (hepatocyte growth factor)/SF (scatter factor) One ligand – one receptor system Diversity determined by cytoplasmic components and adaptor proteins