Biochemie •Česká studijní literatura §Biochemie. Zdeněk Vodrážka. Biochemie. 2. opr. vyd. Praha : Academia, 1996. § §Šípal, Zdeněk. Biochemie. 1. vyd. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1992. § §Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemie. Translated by Arnošt Kotyk. 1. vyd. Praha : Victoria Publishing, 1995. § Biochemie •Anglická studijní literatura §Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemistry. 3rd ed. Hoboken : John Wiley & Sons, 2004 § §Voet, Donald - Voet, Judith G. - Pratt, Charlotte W. Fundamentals of biochemistry :life at the molecular level. 3rd ed. Hoboken, N.J. : John Wiley & Sons, 2008. § §Boyer, Rodney. Concepts in biochemistry. 2nd ed. New York : John Wiley & Sons, 2002. Biochemie –1. ÚVOD –2. BÍLKOVINY - Struktura, vlastnosti a funkce –3. NUKLEOVÉ KYSELINY - Struktura, vlastnosti a funkce –4. SACHARIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –5. LIPIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –6. ENZYMOLOGIE –7. METABOLISMUS A BIOENERGETIKA –8. METABOLISMUS SACHARIDŮ –9. FOTOSYNTÉZA –10.METABOLISMUS LIPIDŮ –11.METABOLISMUS BÍLKOVIN –12.REGULACE BIOCHEMICKÝCH PROCESŮ Biochemie §chemická disciplína, která studuje chemické složení živé hmoty a chemické procesy, které v ní probíhají § §je hraniční vědní disciplínou, na pomezí mezi chemií a biologií, zkoumá biologické objekty chemickými metodami Látkové složení Prvkové složení vesmíru, zemské kůry a člověka Fylogenetický strom Fylogenetický strom Margolis – endosymbiotická teorie Hypothesized origin of mitochondria and chloroplasts Prokaryontní bakteriální buňka Eukaryontní živočišná buňka Eukaryontní rostlinná buňka Organizace biologických struktur figure 1-07c Viry figure 1-07a figure 1-07b figure 1-07d Viry Evoluce života na zemi Evoluce života na zemi Evoluce života na zemi T01-04.jpg 0005BABD Macintosh HD B74677AA: F04-04a.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: F04-04b.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: T04-01a.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Cystin figure 3-06 Cystin F04-05.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Selenocystein unnumbered figure pg 73b Esenciální AMK •Rostliny + mikroorganismy 0 •Člověk – biosyntéza -12 • esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, • Thr, Ile, Leu, Val, Arg? Esenciální AMK •Rostliny + mikroorganismy 0 •Člověk – biosyntéza -12 • esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, • Thr, Ile, Leu, Val, Arg? figure 3-04b figure 3-07 Titrační křivka glycinu F04-06.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Thalidomid Thalidomid thalidomide thalidomid2 L AMK - CO-R-N F04-14.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Diastomery threoninu F04-15.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Ninhydrinová reakce figure 3-09a Reakce AMK s dansylchloridem figure 3-09d Papírová chromatografie AMK RP HPLC AMK F07-06.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: http://static1.comsol.com/shared/images/stories/waters_corp_hplc_systems/html/figure2.jpg Figure 1 figure 3-11a figure 3-11c figure 3-11b figure 3-11e figure 3-11f Proinzulín 84 AMK Inzulín – 51 AMK •Amanitin •Faloidin File:Phalloidin.png File:Alpha-amanitin structure.png Amanita phalloides Microcystiny microcy3 sin_rozklad Microcystiny F07-01.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: figure 3-15 AMK analyzátor AMK analyzátor F07-21.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: F07-22.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: T07-04a.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: T07-04b.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: F07-24.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: Srpkovitá anémie Srpkovitá anémie versus malárie F07-20.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY A.Purifikace bílkoviny – získání homogenn B. B.Aminokyselinové složení – určení počtu jednotlivých AMK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 –110 ºC, 24 h) C. C.Pořadí aminokyselin: 1.Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce(redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2.Určit N-konec a C-konec 3.Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním(kam až to jde) 4.2 nezávislá specifická štěpení → isolovat štěpy (peptidy) 5.Opakovat bod 3. 6.Sestavit primární strukturu řetězce 7.Určit způsob propojení původních řetězců Zjišťování N-koncových AMK F07-03.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: Možnosti štěpení figure 3-17a figure 3-17b figure 3-17c Edmanovo sekvenování F07-04.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: Metoda překrývajících se štěpů MS F07-08a.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: F07-08b.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: MS F07-09.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: MS-MS F07-10.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: MS-MS • MS-MS F07-11.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: F07-35.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: F07-01.jpg 0005D57B Macintosh HD B74677AA: Trans Cis F08-01.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-02.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-04.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-06.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-07.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-08.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: α - helix F08-11.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: α - helix F08-12.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-16a.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-16b.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-18.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-22.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-23.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: figure 4-03 Strukturní motivy F08-46abc.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-46d.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: Strukturní motivy F08-47a.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-47b.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-48.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: Strukturní domény Hemoglobin Rtg difrakce figure 4-15 NMR podstata E NMR NMR NMR spektrum NMR spektrum F08-38a.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: NMR F08-38b.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: Denaturace - renaturace figure 4-14 Skládání – folding bílkovin •Neprobíhá náhodným způsobem • •Probíhá postupně: –a. malé dočasné periodické struktury –b. supersekundární struktury –c. strukturní domény a "roztavená" glubule –d. závěrečné úpravy za účasti enzymů – •Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? Levinthal Paradox •We assume that there are three conformations for each amino acid(ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is : • • 3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 • ≒ 5 x1047. • •If 100 psec(10-10sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require • • 5 x 1047x 10-10 sec ≒1.6 x 1030 years. • •However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process. • figure 4-13 F09-11a.jpg 0005D5EC Macintosh HD B74677AA: F09-11c.jpg 0005D5EC Macintosh HD B74677AA: F09-11d.jpg 0005D5EC Macintosh HD B74677AA: Chaperony Titrační křivka F04-07.jpg 0005D4EA Macintosh HD B74677AA: Izolace proteinů Literatura •Scopes : Protein Purification •Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach •Deutcher : Guide to Protein Purification •Janson : Protein Purification •Kastner : Protein Liqiud Chromatography • • • Metody separace proteinů •Vychází z klasických metod chemické analýzy • •Uplatňují se zde i speciální metody Problémy se vzorkem •Komplexnost • •Malá množství • •Labilita • Plánování separace bílkovin Cíl izolace •Získání homogenní bílkoviny •Zachování biologické aktivity •Čistota • •Závěr : získat vzorek o patřičné • čistotě s vynaložením • patřičného úsilí Volba vstupního materiálu •Preparát z daného organismu • •Preparát s největším obsahem dané bílkoviny •Preparát s nejmenším obsahem nečistot Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 1.99 99 % IEX 25 75 3 1.5 75 % Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda – stanovení N2 •Mineralizace vzorku – převedení • organického dusíku • na NH4+ • •Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, • selektivní elektrody UV spektrofotometrie •280 nm – aromatické AMK • interference nukleotidů • •180 - 230 nm – peptidická vazba • •Výhody - nedestruktivní metoda • - není třeba kalibrace VIS spektrofotometrie Přídavek činidla ® barevný derivát • Destruktivní metoda • Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda •Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí • komplex se 4 N peptidické vazby • • Cu2+ • •Měření : 540 – 560 nm • 310 nm Folinova metoda •Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř • •Měření : 725 nm Lowryho metoda •Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody • •Měření : 600 nm Metoda dle Bradfordové •Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. • •Meření : 595 nm Nejčastěji používané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová 0.5 - 5 okamžitý vývoj Lowryho 0.05 - 0.5 pomalý vývoj UV - 280 nm 0.05 - 2 interference UV – 205 nm 0.01 - 0.05 interference Bradfordové 0.01 - 0.05 sorpce barviva Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf. Vlastní separace Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace Vstupní materiál Mikroorganismy •Bakterie, kvasinky, plísně, řasy • •Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství • - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech • - genetické inženýrství • - termofilní organismy • Bezobratlí •Hmyz, plži, mlži • •Nevýhody - málo se používá, nesnadno se • získává Živočišné tkáně •Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • •Jateční zvířata – orgány • •Člověk – tělní tekutiny Rostlinné tkáně •Špenát, řepa, hrách • •Nevýhoda – problematický růst za • definovaných podmínek Rozbití a extrakce Bakterie •Záleží na lokalizaci • cytoplasma periplasma Balotina •Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit French (X) press •Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk Ultrazvuk •Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) •Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O – bakterie popraskají Živočišné tkáně •Třecí miska s pískem •Ruční homogenizatory – Potter – • Elvehjemův •Mixery •Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně •Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, • •Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Srážecí metody Srážení •Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • •První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 • •Filtrace nahrazena centrifugací • Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + - - Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota • Izoelektrická precipitace pI + - + - - - - - + + + + Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování Vsolování - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Vysolování (NH4)2SO4 •Rozpustnost se málo mění s teplotou •Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) •Levný •Stabilizuje bílkoviny •Relativně čistý Srážení - dvojstupňově Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •COHN – separace plazmatických bílkovin EtOH •Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci •Dvojstupňově •Přídavky z tabulky nebo podle vzorce • Srážení selektivní denaturací •Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • •Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • •Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat • Tepelná denaturace Chromatografické metody Chromatografie • •Cvet – separace chlorofylů na CaCO3 1903 Chromatografie Zařízení pro LPC 71563 Ionexová chromatografie + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce Ionexy •Katexy - - vazba kationtů •silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- •slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- • •Anexy - + vazba aniontů •silné - dietylaminoetyl(DEAE) •slabé – trietylaminoetyl(TEAE) Ionexová chromatografie •Nanášení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – gradientová •Zvyšováním iontové síly •Změnou pH •Afinitní eluce •Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna • pufru • Hydrofobní chromatografie •Stacionární fáze – - C8, -fenyl • •Mobilní fáze – vodné roztoky • 1.7 M (NH4)2SO4 • •Eluce – snižováním iontové síly • •Použití : purifikace bílkovin • Afinitní chromatografie Afinitní páry Afinitní chromatografie nanesení vzorku Afinitní chromatografie vznik interakce Afinitní chromatografie vymytí balastů Afinitní chromatografie eluce Provedení •Nanesení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – selektivní - volným ligandem • – neselektivní - změna pH, iontové • síly, polarity • •Použítí : analytické (stanovení K), purifikace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace Gelová permeační chromatografie •Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% • objemu kolony •Eluce – izokratická • •Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace Elektromigrační metody Podstata • • •„Pohyb elektricky nabitých částic •v elektrickém poli“ Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - - mA > mB >mC Upořádání Horizontální + - + - Upořádání Vertikální Polyakrylamid •Složení – kopolymer akrylamidu a • N,N,- methylenbisakrylamidu • •+ plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! - •Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS Þ uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Log Mr Rm Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy 1046053 67771 Izoelektrická fokusace • •„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Izoelektrická fokusace pH + - H3O+ OH- A + - H3O+ OH- A pI t0 t1 Izoelektrická fokusace + - H3O+ OH- pH tx Izoelektrická fokusace analytická •Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • •Použití - sledování komplexních směsí • - izoenzymové složení • - stanovení pI – rozřezání a eluce • – mpH elektrody • – pI standardy • Izoelektrická fokusace analytická 1046056 10% Dvojrozměrná elektroforéza 10% pI Mr I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE pH 3.0 10.0 Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM F32-072.jpg 001177E5 Macintosh HD B74677AA: F08-29.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-30a.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-33.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: F08-32.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: Kolagen v kůži F08-31.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: α - keratin figure 4-25 F08-26.jpg 0005D5B7 Macintosh HD B74677AA: α – keratin - vlas β - keratin β - keratin