Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE –- kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC –- pyrolýzní hmotnostní spektrometrie –- analýza polutantů v životním prostředí –- farmakokinetické studie –- kvantifikace proteinů - priony –- analýza nukleových kyselin –IDENTIFIKACE LÁTEK, STRUKTURNÍ ANALÝZA, PRVKOVÁ ANALÝZA, KVANTITATIVNÍ ANALÝZA –- použití vnitřního standardu Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE –- MS - mass spectrometry –- MS - mass spectrometer –- MS - mass spectrum – –- destruktivní metoda, minimální spotřeba vzorku – –SPEKTROMETR - iontově-optické zařízení – - separace iontů podle m/z Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE –- 1899 - počátky hmotnostní spektrometrie –- cca 1940 - použití v petrochemickém průmyslu –- 1946 - TOF MS - „time of flight“ –- 1953 - kvadrupólová MS –- 1956 - identifikace organických látek pomocí MS –- 1964 - GC-MS –- 1966 - chemická ionizace –- 1980 - ICP-MS –- 1996 - MS viru Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- vstup - zavedení vzorku –- iontový zdroj - ionizace –- separátor (analyzátor) - separace iontů podle m/z –- detektor - četnost daného typu iontů –- zpracování signálu - spektrální výstup –- vakuový systém - vyloučení srážek iontů – Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- vstup - zavádění vzorku do spektrometru – - přímý vstup – - přes zásobník - studený či vyhřívaný – - chromatografický vstup - GC – - LC Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- iontový zdroj - ionizace a fragmentace vzorku – - elektronová ionizace - ionizace nárazem elektronů - EI - electron ionization (impact) – - chemická ionizace - CI – - ionizace urychlenými atomy - FAB – - ionizace polem - FI – - ionizace laserem za účasti matrice - MALDI – - termosprej - TSI, plasmasprej - PSI – - elektrosprej - ESI Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - elektronová ionizace - EI – - konvenční technika (od roku 1913) – - M + e- M+ + 2 e- – - „tvrdá“ ionizační technika – - fragmentace molekuly na menší části – - slabá intenzita molekulárního píku – - těkavé látky – - termostabilní látky Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU - elektronová ionizace - EI – Re či W M+ urychlující potenciál e- 5 - 100 eV - běžně 70 eV záporně nabité ionty - záchyt e- vychytávány vytlačovací elektrodou Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - chemická ionizace - CI – - konstrukce zdroje podobná jako pro EI – - ve zdroji přítomen REAKČNÍ PLYN v nadbytku vůči vzorku – - ionizace reakčního plynu - methan, amoniak, isobutan, propan, voda, dusík - reakce iontů s molekulami analytu – - tvorba aduktů – Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - chemická ionizace - CI – - základní mechanismy ion-molekulárních reakcí R + e- R+ + 2 e- (ionizace reakčního plynu) – R + R+ [R-H] + [R+H]+ (ion-mol. reakce plynu) – R + R+ [R-H]+ + [R+H] (ion-mol. reakce plynu) – [R+H]+ + M R + [M+H]+ (protonace) – [R-H]+ + M R + [M-H]+ (abstrakce hydridu) – R+ + M [R+M]+ (kondenzace) – R+ + M R + M+ (výměna náboje) Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - chemická ionizace - CI – - méně výrazná fragmentace než u EI – – - též vznik záporných iontů – - záchyt elektronu – - deprotonace – - adice halogenidu Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - ionizace urychlenými atomy - FAB – - urychlené atomy Xe, Ar – - na terčíku vzorek ve viskosní matrici – - matrice - chemicky inertní, málo těkavá – - glycerol, thioglycerol – - kapalné kovy - Ga, In – - vznik aduktů (s matricí) – - jedna z šetrnějších ionizačních technik – Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - ionizace laserem za účasti matrice - MALDI – - velmi šetrná ionizační technika – - vhodné pro biomolekuly - proteiny, oligosacharidy –- pulzní lasery - UV - dusíkový - 337 nm – (4 ns) - IR - Er-YAG - 2940 nm – -matrice musí absorbovat laserové záření - – - kys. dihydroxybenzoová, chlorsalicylová, skořicová, nikotinová – - nutný přebytek matrice (5000 :1) –- kovová podložka - terč C:\Dokumenty\2ach\maldi.bmp Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU - MALDI – [M+H]+ Specifické aspekty jednotlivých metod –IONIZACE VZORKU – - ionizace elektrosprejem - ESI – - velmi šetrná ionizační technika – - vhodné pro biomolekuly – - vhodné pro vzorky v roztoku (výstup z LC) – - „vypařování iontů“ - rostoucí hustota náboje ve zmenšující se kapičce – - na kovové kapiláře vloženo vysoké napětí na rozdíl od termosprejové ionizace TSI – (TSI - vyhřívaná kapilára) –IONIZACE VZORKU –- ionizace elektrosprejem - ESI – C:\Pavel\2ach\ESI.bmp DUSÍK Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- separátory iontů - analyzátory - vysoké vakuum – - sektorové (magnetické pole + elektrická fokusace) – - kvadrupolové (vysokofrekvenční pole) – - iontová past (vysokofrekvenční pole) – - průletový analyzátor - TOF – - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- separátory iontů - analyzátory - vysoké vakuum – KLÍČOVÝ PARAMETR - rozlišovací schopnost (resolving power - RP) – RP = m1/(m1 - m2) (dva stejně vysoké píky, údolí mezi nimi 10% jejich výšky) – RP = m/ΔmFWHM – –spektrální ROZLIŠENÍ - reciproká hodnota RP - relativní ještě rozlišitelný rozdíl hmotností Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů –- magnetický – s jednoduchou – fokusací – - zakřivení dráhy – letu iontů –těžší ionty - –větší odstředivá síla – –- kruhová výseč C:\Dokumenty\2ach\stazeno\Msjednoduchafokusace.bmp Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - magnetický separátor – Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů –- magnetický s jednoduchou fokusací – - zakřivení dráhy letu – - dostředivá síla (B e v) - úměrná magnetické indukci – - odstředivá síla - mv2/r – - při konstantním urychlovacím potenciálu a konstantní magnetické indukci odpovídá určité hmotnosti částic určitý poloměr zakřivení –- pro proměření spektra nutno plynule měnit buď urychlovací potenciál nebo magnetickou indukci –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů –- kvadrupolový separátor - hmotnostní „filtr“ – - různá stabilita oscilací iontů v kombinaci stejnosměrného napětí a vysokofrekvenční střídavé složky (10 MHz) buď plynulá změna radiofrekvence nebo současná změna hodnoty stejnosměrného napětí a amplitudy oscilací prstencová elektroda –separátory iontů - iontová past - radiofrekvenčně modulované pole, možnost MSn analýzy C:\Dokumenty\2ach\IONTRAP.BMP vstupní uzavírací elektroda výstupní uzavírací elektroda –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů –- průletový analyzátor - TOF - různá doba letu iontů – – lehčí atomy jsou rychlejší –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- separátory iontů - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) – - záchyt na cykloidálních drahách –- různé absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném silném magnetickém (6 až 7 Tesla) a elektrickém poli –- každá hodnota m/z má charakteristickou cyklotronovou frekvenci –- vysoké rozlišení, vysoká přesnost, vysoká cena Specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- separátory iontů - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) – Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- detektor - četnost daného typu iontů – - elektronový násobič – - kombinovaný fotonásobič - dopad iontů na fosforovou destičku - vyzáření fotonu - zesílení signálu – - Faradayova klec - dopad iontů na sběrnou elektrodu, jejich vybití, záznam změny proudu – Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR –- vakuový systém - vyloučení srážek iontů v analyzátoru – - hodnota vakua závislá na typu analyzátoru – - ICR - 10-5 - 10-9 Pa – - sektorové - 10-5 - 10-6 Pa – - kvadrupolový, TOF - cca 10-3 Pa – - iontová past - cca 10-3 Pa – - vícestupňová čerpání - rotační vývěvy, turbomolekulární, difusní pumpy Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - identifikace látek – –- srovnání měřených spekter s knihovnami dat – - různé porovnávací algoritmy – –- analýza molekulového píku, píků fragmentů a rozdílů mezi nimi – –- empirická pravidla Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvantita – –- SLEDOVÁNÍ výšky píků pro vybraná m/z - SIM – „SELECTIVE ION MASS“ – –- GC-MS/MS - stanovení farmak v krevní plasmě – - použití vnitřního standardu Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE C:\Dokumenty\2ach\stazeno\MSinternal.bmp SIGNÁL při m/z vzorku SIGNÁL při m/z standardu Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod –HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE C:\Dokumenty\2ach\stazeno\APEXIV3.GIF C:\Dokumenty\2ach\stazeno\BIOTOFQ3.GIF FT-MS TOF-MS