Kapalinová chromatografie - LC •Fyzikálně-chemická metoda dělení kapalin (roztoků) využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze, nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní), přičemž pohyblivou fází je kapalina. –DIFUSNÍ KOEFICIENTY O 5 ŘÁDŮ MENŠÍ NEŽ V GC •malý vliv molekulární difuse, velký význam odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi, PROBLÉM TURBULENCÍ MOBILNÍ FÁZE •GIDDINGSOVA TEORIE •LLC a LSC, dále GPC, IEC •TECHNIKY SLOUPCOVÉ CHROMATOGRAFIE –systém otevřený – nízkotlaký - Low (Medium) Pressure Liquid Chromatography –systém uzavřený – vysokotlaký - High Performance Liquid Chromatography Kapalinová chromatografie •TEORIE LLC (kapalinová rozdělovací) –kapalná mobilní i stacionární fáze (zakotvená na tuhém nosiči) –OBĚ KAPALINY NEMÍSITELNÉ •obtížné splnit - řešení CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze •poměr objemů Vm/Vs posunut ve prospěch mobilní fáze - pro retenci látek - NUTNÁ ODLIŠNÁ POLARITA OBOU FÁZÍ •CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze - obvykle NEPOLÁRNÍ –MOBILNÍ FÁZE - POLÁRNÍ »tzv. OBRÁCENÉ FÁZE („reversed-phase“) Kapalinová chromatografie •STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC –chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL •PORÉZNÍ ČÁSTICE NEPRAVIDELNÉHO TVARU •PORÉZNÍ ČÁSTICE KULOVITÉHO TVARU –komerčně dostupné silikagely s definovanou velikostí částic •SILANOLOVÉ SKUPINY - Si-OH NA POVRCHU ČÁSTIC –REAKCE S MODIFIKÁTOREM »např. OKTADECYLTRICHLORSILAN •AMINOPROPYLOVÉ SKUPINY - (CH2)3-NH2 NA POVRCHU ČÁSTIC –REAKCE S MODIFIKÁTOREM - TVORBA AMIDŮ Kapalinová chromatografie •STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC –chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL •odstranění zbylých -OH skupin trimethylsilylovými skupinami •funkční modifikace sorbentů –uhlovodíkové skupiny (řetězce) - oktadecyl, fenyl, oktyl atp. –nitrily -CºN, dioly, aminy –účelové modifikace sorbentů - makrocyklické látky, opticky aktivní látky atp. –makroporézní gely organických látek - uhlovodíků •funkční skupiny přímo na matrici gelu Kapalinová chromatografie •MOBILNÍ FÁZE pro LLC –v RP-LLC - obvykle polární •ALKOHOLY - methanol, ethanol, propanol, isopropanol •NITRILY - acetonitril •ETHERY - tetrahydrofuran, dioxan, diethylether –mnohdy ve směsi s vodou, směsi i více rozpouštědel – •ŘADA DLE ELUČNÍ SÍLY –větší eluční síla Ù kratší retenční časy –voda - methanol - acetonitril - tetrahydrofuran - aceton • •VHODNÁ NÍZKÁ VISKOSITA •VHODNÁ TRANSPARENTNOST V UV OBLASTI Kapalinová chromatografie •SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC –na nepolárních stacionárních fázích - nejvíce zadržovány n-ALKANY •RETENCE ROSTE SE STOUPAJÍCÍ MOLEKULOVOU HMOTNOSTÍ –méně zadržovány - AROMÁTY, HALOGENOVANÉ UHLOVODÍKY –ještě méně zadržovány (v řadě) - ethery, nitroderiváty, estery, aminy, amidy, karboxylové kyseliny, sulfokyseliny –retence polárních látek velmi malá - lze ovlivnit volbou pH* –retence iontových látek (solí) - prakticky nulová - lze ovlivnit volbou pH* Kapalinová chromatografie •SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC –vliv pH* na změnu kapacitních poměrů •V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA IONIZACE BAZÍ - zvýšení jejich retence •V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ ZNAČNÁ DISOCIACE KYSELIN - omezení jejich retence • •V KYSELÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA DISOCIACE SLABÝCH KYSELIN - zvýšení jejich retence •V KYSELÉM PROSTŘEDÍ PROTONACE BAZÍ - omezení jejich retence Kapalinová chromatografie •SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC –vliv pH* na změnu kapacitních poměrů Kapalinová chromatografie •SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC –vliv pH* na změnu kapacitních poměrů Kapalinová chromatografie •TEORIE LSC (kapalinová adsorpční) –interakce složek vzorku v mobilní fázi s adsorbentem (tuhou stacionární fází) •ADSORBENT - kulovité částice - Æ ~ 10 μm •adsorpční distribuční konstanty –obsah složky J ve stacionární fázi - mol.g-1 –obsah složky J v mobilní fázi - mol.cm-3 •MECHANISMUS ADSORPCE –POVRCH ADSORBENTU OBSAZEN ELUENTEM –SILNĚJI SE ADSORBUJÍCÍ SLOŽKA VYTĚSŇUJE ELUENT Kapalinová chromatografie •MECHANISMUS ADSORPCE –adsorpční rovnováha - popis - ADSORPČNÍ ISOTERMY –LANGMUIROVA ISOTERMA - tvorba monovrstvy – – » »lineární v oboru nízkých koncentrací –tvar isotermy ovlivňuje tvar chromatografického píku »Gaussův profil pro lineární isotermu »„protažené píky“ („chvostování“) - nelineární část isotermy (příliš vysoké koncentrace) Kapalinová chromatografie •STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC •ADSORBENT - kulovité částice - Æ ~ 10 μm •obvykle silně polární •plně porézní –silikagel - hydratované SiO2 - KYSELOST POVRCHU »NUTNÁ AKTIVACE - „přiměřené“ vysušení »SILNÁ RETENCE BAZICKÝCH LÁTEK »silikagel s velkými póry »s malými póry - pod 10 nm –alumina - OXID HLINITÝ - hydroxylové skupiny na povrchu - silné elektrostatické pole u povrchu –Florisil - křemičitan hořečnatý Kapalinová chromatografie •STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC •ADSORBENT - kulovité částice - Æ ~ 10 μm –alumina - OXID HLINITÝ »BAZICITA POVRCHU - DĚLENÍ SLABĚ KYSELÝCH SLOŽEK » - silné kyseliny - CHEMISORPCE »silné elektrostatické pole u povrchu »při přiblížení adsorbátu - v molekule indukovaný dipól-moment »vliv geometrie adsorbátu - (ne)planarita »AKTIVACE -podobná jako u silikagelu – –Florisil - křemičitan hořečnatý Kapalinová chromatografie •STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC •ADSORBENT - kulovité částice - Æ ~ 10 μm –Florisil - křemičitan hořečnatý »polární adsorbent »vlastnosti - mezi silikagelem a aluminou »84% SiO2, 15,5% MgO, 0,5% Na2SO4 »ENVIRONMENTÁLNÍ ANALÝZY »SEPARACE POLÁRNÍCH LÁTEK z nepolárních matric »separace chlorovaných pesticidů a PCB »analýza organofosfátů »separace steroidů »separace dusíkatých látek od uhlovodíků Kapalinová chromatografie •MOBILNÍ FÁZE pro LSC –odplyněná, zbavená prachových částic –nepolární mobilní fáze (polární jsou adsorbenty) –stupnice dle eluční síly (empirický parametr) •větší eluční síla - eluent pevněji sorbován •pentan - cyklohexan - benzen - diethylether - dichlormethan - aceton - isopropanol - voda •BĚŽNĚ POUŽÍVÁNY BINÁRNÍ ELUENTY –např. HEXAN + diethylether – –GRADIENTOVÁ ELUČNÍ CHROMATOGRAFIE »PLYNULÉ ČI „SKOKOVÉ“ ZMĚNY SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE Kapalinová chromatografie •SEPAROVANÉ SLOŽKY v LSC –polární sorbent Ù více zadržovány polární látky, látky s větší molekulovou hmotností –málo zadržovány - nepolární uhlovodíky – –na kyselém sorbentu - více zadržovány bazické látky – –na bazickém sorbentu - více zadržovány kyseliny •Kapalinová chromatografie - LC C:\david\sepmeth\eighth\eighth2\1hplc4.gif Uzavřený systém pro HPLC 1. Zásobník mobilní fáze 2. Vysokotlaká čerpadla 3. Měřidlo tlaku 4. Filtr 5. Tlumič tlakových pulsů 6. Kolona 7.Dávkovač vzorku - pomocí ventilů 8. Detektor(y) 9. Vyhodnocovací zařízení •Kapalinová chromatografie - LC •Typy kolon pro HPLC - dle vnitřního průměru –KAPILÁRNÍ KOLONY ~ desítky až stovky mikrometrů –MIKROKOLONY ~ 1 mm –„NARROW-BORE“ KOLONY ~ 2 mm –ANALYTICKÉ KOLONY ~ 2 - 10 mm –SEMIPREPARATIVNÍ KOLONY ~ 10 - 25 mm –PREPARATIVNÍ KOLONY - nad 25 mm •délky - běžně - 10 - 100 cm •MATERIÁLY –nerezová ocel –tvrzené sklo –Ti-Zr –PEEK - poly(ether-ether-ketone), /poly(arylether-ether-ketone) •Kapalinová chromatografie - LC •Detektory pro LC –CHYBÍ UNIVERZÁLNÍ –OBTÍŽNÁ PREDIKCE ZÁVISLOSTI ODEZVY NA KONCENTRACI JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK –SLOŽITÉ KALIBRACE PRO KVANTITATIVNÍ ANALÝZU - NEPŘENOSNÉ MEZI PŘÍSTROJI – –OPTICKÉ, ELEKTROCHEMICKÉ –„POMLČKOVÉ TECHNIKY“ - LC-MS, LC-FTIR atd. •Kapalinová chromatografie - LC •Typy detektorů pro LC - –OPTICKÉ •fotometrický - nejvíce rozšířen v kolonové chromatografii »UV-vis-fotometr •fluorometrický - řádově vyšší citlivost a nižší mez detekce než pro fotometrický detektor •refraktometrický - měření indexu lomu a jeho změn, pro jakýkoli typ látky, - NELZE PŘI GRADIENTOVÉ ELUCI –ELEKTROCHEMICKÉ •voltametrický resp. amperometrický - nutnou podmínkou dobrá vodivost samotné mobilní fáze •vodivostní - iontové formy složek vzorku, omezené použití •Kapalinová chromatografie - LC •Typy detektorů pro LC - –fotometrický/spektrofotometrický - •průtočná cela - objem 5 - 10 μl, optická dráha - 10 mm •deuteriová výbojka pro UV oblast, halogenová žárovka pro viditelnou oblast •různé vlnové délky - nastavitelné - jednokanálová detekce •měření širšího spektrálního úseku - mnohakanálová detekce - diodová pole (CCD) •problém eluentů absorbujících v UV oblasti •problémy při gradientové eluci • •Kapalinová chromatografie - LC •Typy detektorů pro LC - –fluorimetrický/spektrofluorimetrický - •průtočná cela - objem 5 - 10 μl, •deuteriová výbojka pro UV oblast, halogenová žárovka pro viditelnou oblast •EXCITAČNÍ MONOCHROMÁTOR •různé vlnové délky EMITOVANÉHO záření - nastavitelné - jednokanálová detekce •měření širšího spektrálního úseku - mnohakanálová detekce - diodová pole (CCD) •VYSOKÁ CITLIVOST, MOŽNOST DETEKCE NIŽŠÍCH KONCENTRACÍ NEŽ FOTOMETRICKY •složky musí fluoreskovat, nebo je možné je snadno převést na fluoreskující látky •Kapalinová chromatografie - LC •Typy detektorů pro LC - –diferenciální refraktometrický - •kontinuální záznam ROZDÍLU indexů lomu mezi výtokem z kolony a čistým elučním činidlem •použitelné pro jakýkoli typ látky •NELZE POUŽÍT PRO GRADIENTOVOU ELUCI •INDEX LOMU SE MĚNÍ S TEPLOTOU - NUTNO TERMOSTATOVAT •málo citlivé •POUŽITÍ TAM, KDE NELZE POUŽÍT PŘEDCHOZÍ UVÁDĚNÉ DETEKTORY • •Kapalinová chromatografie - LC •Typy detektorů pro LC - –voltametrický/amperometrický - •vhodný pro organické depolarizárory (látky oxidovatelné či látky redukovatelné) •obvykle měření při konstantním potenciálu •průtočné uspořádání •jedna polarizovatelná elektroda –dvou- či tří- elektrodové zapojení •využití oxidační reakce - fenoly, aromatické aminy, thioly, peroxidy •využití redukční reakce - ketony, aldehydy, nitrosloučeniny, konjugované estery, konjugované nitrily •NUTNÁ DOSTATEČNÁ VODIVOST MOBILNÍ FÁZE • •GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC •DĚLENÍ DLE ROZDÍLŮ VE VELIKOSTI MOLEKUL –STACIONÁRNÍ FÁZE - póry o definované velikosti –MOBILNÍ FÁZE - teoreticky pouze transport látek –dělení složek podle HYDRODYNAMICKÉHO PRŮMĚRU MOLEKUL –MENŠÍ MOLEKULY VSTUPUJÍ DO PÓRŮ •čím menší molekuly, tím více času stráví v pórech •otázka velikosti pórů, jejich uniformity a tvaru •sekundární efekt - adsorpce •VR,J = A - B log Mr(J) –použitelné pro homologické řady látek –problém strukturně odlišných látek •GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC •DĚLENÍ DLE ROZDÍLŮ VE VELIKOSTI MOLEKUL –STACIONÁRNÍ FÁZE •univerzální - silikagely a skelné materiály - Porasil, Spherosil, Bio-Glass •pro vodné mobilní fáze (tlumivé roztoky) - dělení polypetidů, proteinů a dalších biomakromolekul - Sephadexy - dextran zesíťovaný epichlorhydrinem •pro organické eluenty (jako eluent běžně THF) –divinylbenzenem zesíťovaný polystyren - Styragel – –PRÁCE ZA BĚŽNÉ ČI ZVÝŠENÉ TEPLOTY •IONTOVÁ chromatografie - IEC •IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE –SEPARACE NABITÝCH ČÁSTIC - IONTŮ –nenabité částice teoreticky procházejí bez zadržení •ZÁKLAD STACIONÁRNÍ FÁZE - MĚNIČE IONTŮ - IONTOMĚNIČE – nosič - zesíťovaný polystyren, porézní silikagel •na stacionární fázi chemicky navázané ionty, k nim elektrostaticky fixovány opačně nabité protiionty –protiionty shodné s jedním z iotů mobilní fáze –PŘI SEPARACI protiion ZAMĚNĚN ZA STEJNĚ NABITÝ ION SEPAROVANÉ SLOŽKY, zpětná záměna přebytkem iontů z mobilní fáze »DOBA SETRVÁNÍ IONTU SLOŽKY NA POVRCHU •IONTOVÁ chromatografie - IEC •IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE •AFINITA POHYBUJÍCÍCH SE IONTŮ K FIXOVANÉMU IONTOVÉMU MÍSTU •OBVYKLE VE VODNÉM PROSTŘEDÍ –KATEXY - VÝMĚNA KATIONTŮ - silně a slabě kyselé »CHEMICKY VÁZANÉ ANIONTY - SULFONOVÉ SKUPINY - KARBOXYLOVÉ SKUPINY »VÝMĚNA PROTONŮ, SODÍKOVÝCH IONTŮ, DRASELNÝCH –ANEXY - VÝMĚNA ANIONTŮ - silně a slabě bazické »KVARTÉRNÍ DUSÍKATÉ BÁZE »PRIMÁRNÍ ČI SEKUNDÁRNÍ AMINY •IONTOVÁ chromatografie - IEC •IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE –DOBA SETRVÁNÍ IONTU SLOŽKY NA POVRCHU •IONTY S VĚTŠÍM NÁBOJEM ZADRŽOVÁNY VÍCE •IONTY S VĚTŠÍ HMOTNOSTÍ ZADRŽOVÁNY VÍCE •otázka disociačních rovnováh - nutná podpora disociace slabých protolytů – –DETEKCE •VODIVOSTNÍ DETEKTOR - nutno předem potlačit velkou vodivost H+ nebo OH- (potlačovací kolona před detektorem) •pro některé anionty - FOTOMETRICKÝ DETEKTOR •chromatografie •S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC •MOBILNÍ FÁZE - ZKAPALNĚNÝ PLYN - (CO2) –kolona má vyšší teplotu než je kritická teplota zkapalněného plynu –pracovní tlak značně vyšší než tlak kritický –v koloně „velmi hustý plyn“ •klíčová rozpouštěcí schopnost SF mobilních fází –pro SF CO2 - podobná hexanu •nízká viskosita proti kapalinám •vyšší difusní koeficienty než v kapalinách –VHODNÉ PRO VYSOKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY •chromatografie •S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC •MOBILNÍ FÁZE - ZKAPALNĚNÝ PLYN - (CO2) –VHODNÉ PRO VYSOKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY •látky, které nelze převést do plynné fáze (hmotnost, termolabilita) - NEPOUŽITELNÁ GC •látky nelze detegovat běžnými detektory kapalinové chromatografie - NEPOUŽITELNÁ LC •CHROMATOGRAF PODOBNÝ JAKO PRO GC –doplněno DÁVKOVAČEM zkapalněného plynu –preferovány KAPILÁRNÍ kolony –kolony o menším průměru (0,05 - 0,1 mm) a kratší délce (5 - 10 m) než v GC •chromatografie •S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC •MOBILNÍ FÁZE - ZKAPALNĚNÝ PLYN - (CO2) •CHROMATOGRAF PODOBNÝ JAKO PRO GC • •DETEKTOR - obvykle PLAMENOVÝ IONIZAČNÍ •lze kombinovat s MS detekcí •namísto gradientu složení mobilní fáze (LC) nebo teplotního programu (GC) - programově řízený TLAK v SFC •chromatografie •S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC •MOBILNÍ FÁZE - ZKAPALNĚNÝ PLYN - –CO2 - neběžnější, pro polární látky přídavek methanolu –SF6, - vyšší kritická teplota, nižší kritický tlak, problém koroze FID –xenon - nízká kritická teplota , NEABSORBUJE V UV-oblasti - použitelná fotometrická detekce •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •POHYB NABITÝCH ČÁSTIC VLIVEM STEJNOSMĚRNÉHO ELEKTRICKÉHO POLE •dělení v kapalné fázi („kapalné fázi“) •polární prostředí (mnohdy vodné) •síla působící na nabitou částici –F1 = Q E = ze E , E - intenzita pole •uvedení iontů do pohybu •síla brzdná - odpor prostředí –F2 = -k v = - 6π η r v, v - rychlost pohybu částice, η - dynamická viskosita r - poloměr iontu •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •POHYB NABITÝCH ČÁSTIC VLIVEM STEJNOSMĚRNÉHO ELEKTRICKÉHO POLE –Q E = k v –v = Q E / k = u E, u - pohyblivost částice –pohyblivost částice - ovlivněna •viskositou prostředí •rozměrem a tvarem iontů •nábojem iontů •mírou disociace dané látky • •DĚLĚNÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ •u = v / E, konstantní E - ELEKTROFORÉZA konstantní v - IZOTACHOFORÉZA •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •DĚLĚNÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ –u = v / E, –konstantní E - ELEKTROFORÉZA •1892 - POHYB ANORGANICKÝCH ČÁSTIC V KOLOIDNÍM ROZTOKU •1937 - METODA POHYBLIVÉHO ROZHRANÍ - Arne Thiselius - dělení proteinů krevního séra (1948 - Nobelova cena) •1949 - ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA - Pauling (papírový nosič) •1955 - GELOVÁ ELEKTROFORÉZA - Smithies (škrobový gel) •1981 - KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA - Jorgenson a Lukacsová •současnost - ELEKTROFORÉZA NA CHEMICKÝCH MIKROČIPECH •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •ELEKTROFORÉZA - ELFO –KAPILÁRNÍ •Kapilární zónová elektroforéza (CZE) •Kapilární gelová elektroforéza (CGE) – –GELOVÁ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA •VERTIKÁLNÍ, HORIZONTÁLNÍ, VÍCEROZMĚRNÁ •ŠKROB - SGE („STARCH“) •POLYAKRYLAMID - PAGE („POLYACRYLAMIDE“) •ACETYLCELULOSA - CAGE („Cellulose Acetate“) •AGAROSA (agar) - AGE („AGAROSE“) • •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •2D - ELEKTROFORÉZA například: • jeden směr IFE • separace dle pI • druhý směr SDS-PAGE (SDS - dodecylsulfát sodný) • dělení dle molekulové hmotnosti •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •ELEKTROFORÉZA - ELFO –KAPILÁRNÍ - křemenná kapilára s polyimidovým povlakem (průměr 25 - 75 μm) •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •ELEKTROFORÉZA - ELFO –KAPILÁRNÍ - křemenná kapilára s polyimidovým povlakem •objem kapiláry - méně než 10 μl •kapilára obvykle vyplněna pufrem, gelem - zlepšení separace makromolekul •dávka vzorku - 10 nl •napětí 10 - 30 kV •obvykle spektrofotometrická detekce v „okénku“ v místě bez polyimidového povlaku •detekce fluorescenční - LIF - laserem indukovaná fluorescence •doba separace - do 10 min •peptidy, proteiny, nukleové kyseliny •anorganické kationty a anionty •iontová farmaka, huminové kyseliny, analýza potravin •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •DĚLENÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ –u = v / E, –konstantní v - IZOTACHOFORÉZA •kapilární - objev v 60. letech 20.století •dva elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů •elektrolyt s VELKOU pohyblivostí - VEDOUCÍ •elektrolyt s MALOU pohyblivostí - KONCOVÝ •VZOREK VNÁŠEN NA ROZHRANÍ ELEKTROLYTŮ –VZOREK SE DĚLÍ DLE POHYBLIVOSTI IONTŮ V NĚM OBSAŽENÝCH - vytváří zóny mezi vedoucím a koncovým elektrolytem - SAMOZAOSTŘUJÍCÍ EFEKT –všechny zóny se pohybují stejnou rychlostí •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •IZOTACHOFORÉZA - pohyb aniontů ustálený stav •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •IZOTACHOFOREGRAM •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •IZOTACHOFOREGRAM –VÝŠKA ZÓNY - kvalitativní informace o iontech •souvisí s vodivostí dané zóny - s pohyblivostí iontů – –DÉLKA ZÓNY - KVANTITATIVNÍ INFORMACE •koncentrace látek v zónách dána složením a koncentrací vedoucího elektrolytu (všemi zónami protéká stejný proud) - pro danou látku konstantní přes celou zónu - délkou zóny tak dáno celkové látkové množství daného iontu – –DÉLKA ZÓNY - vzdálenost maxim na derivačním záznamu •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •konstantní v - IZOTACHOFORÉZA –intenzita elektrického pole charakteristická pro zónu –KATIONTOVÁ - DĚLENÍ DLE POHYBLIVOSTI KATIONTŮ –ANIONTOVÁ - DĚLENÍ DLE POHYBLIVOSTI ANIONTŮ –INSTRUMENTÁLNÍ VYBAVENÍ –separační kapilára - průměr 0,5 mm, délka až 50 cm, PTFE, FEP - perfluorovaný PE + PP –objem vzorky - mikrolitry - kohout či stříkačka –používané napětí - řádově kV –STABILIZOVANÝ PROUD - STOVKY MIKROAMPÉR –vodivostní detektor, teplotní detektor, UV-detektor •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •konstantní v - IZOTACHOFORÉZA –INSTRUMENTÁLNÍ VYBAVENÍ ITP_obec.bmp separační kapilára koncový elektrolyt vedoucí elektrolyt zdroj konstantního proudu •ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • •konstantní v - IZOTACHOFORÉZA –aplikace •ANALÝZA IONOGENNÍCH LÁTEK V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •ANALÝZA POTRAVIN •BIOCHEMICKÁ ANALÝZA – –KOMBINACE IZOTACHOFORÉZY A ELEKTROFORÉZY •IZOTACHOFORÉZA - ZAKONCENTROVÁNÍ SLOŽEK DO ZÓN •ELEKTROFORÉZA - VYSOKÉ ROZLIŠENÍ SLOŽEK