GLP v biologii – syllabus
(Luděk Bláha, RECETOX)
GLP v biologii – základy QA/QC
Přehled aplikací a postupů vyžadujících GLP + příkladová studie
Vybraná témata detailněji:
Léčiva a jejich regulace
Zajištění zdraví člověka (a zajištění parametrů kvality)
Bezpečnost látek pro člověka - toxikologické studie
Laboratorní a pokusná zvířata
Bezpečnost látek pro prostředí - ekotoxikologie
Alternativní testovací systémy
Problematika GMO
Co vyžaduje SLP ?
…zákony
http://www.mvcr.cz/
clanek/sbirka-zakonu.aspx
Archiv do 2008
Nové
GLP v biologii - úvod
• BIOLOGIE – experimentální věda vs. Praktická
biologie/biochemie/mikrobiologie atd.
• Nutnost dodržovat GLP zejména,když výsledky jsou využity
při rozhodování
= Praktická biologie a biochemie
– Léčiva (registrace/povolení, výroba, kontrola, přípravy…)
– Lékařská biologie a biochemie
– Mikrobiologická kvalita (potraviny, pitná voda)
– Průmyslové chemické látky, potravní aditiva, potenciálně nebezpečné
agens (geneticky modifikované organismy) .. a jejich bezpečnost =
toxikologie, ekotoxikologie, biodegradabilita,
– Další zákonem dané oblasti ve vztahu k biologii – dodržení etických
požadavků (např. práce se zvířaty/obratlovci)
GLP v biologii – základní principy a
příkladová STUDIE
• V Biologii platí stejné principy jako pro
chemické analýzy (viz předchozí přednášky –
QA/QC, detailní SOPs, dokumentace …)
• Příklad - „jednoduché“ STUDIE v režimu GLP
Příkladová STUDIE (viz příloha)
• Cíl studie:
• Podkladový materiál pro registraci (povolení) využití aspirinu u prasat
• Jeden z dílčích podkladových materiálů - popis farmakokinetiky aspirinu u
prasat po jednorázovém podání (příklad)
• Experimentální design:
• 8 zvířat (prasat), jednorázová aplikace aspirinu
• odběry krve v definovaných časech (0-144 h)
• sledování hladin metabolitů K. AcSal a vyhodnocení
• Realizace:
• 1) Plán projektu (100 stran + přílohy SOPs)
• 2) Výstup – Zpráva z realizace (detailní dokumentace vč. Veškerých
odchylek)
• Přímá – jmenovitá – odpovědnost konkrétních osob … atd.
GLP v biologii 1 – Léčiva
GLP v biologii 1 – Léčiva
• GLP & přesná dokumentace vyžadována u
humánních i veterinárních léčiv:
– Registrace před použitím
• průkaz a dokumentace farmakokinetiky, cílové aktivity ve
srovnání s existujícími postupy, bezpečnost pro lidi + nově i
pro životní prostředí …
– Dokumentace celého životního cyklu - výroba, přípravy v
lékárnách, kontrola kvality, aplikace, reporting vedlejších účinků,
likvidace (nebezpečný odpad)
– Státní autority:
• SÚKL (Státní úřad pro kontrolu léčiv)
• ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních
biopreparátů a léčiv)
www.sukl.cz
www.uskvbl.cz
Vývoj nových léčiv
Vývoj nových léčiv
Internet Pfizer
GLP v biologii 1 – Léčiva
• Základní zákonný dokument:
• Český lékopis
(viz příklad: ke zkoušce znát vnitřní strukturu a základní obsah)
• Aktuální: Vyhl. MZd z roku 2009 (dopl. 2010)
• Požadavky na jakost, postup při přípravě,
zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv
• Řada dalších dílčích norem
(např. požadavky na přípravy/nakládání s cytotoxickými léčivy =
vedlejší karcinogenní účinky …)
GLP v biologii 2
– ochrana (zdraví) člověka -
GLP v biologii 2 – zdraví člověka
• Zdraví člověka ovlivňuje řada faktorů, jejichž KVALITA musí
být kontrolována (státem) a GLP hraje významnou roli:
- preklinické studie léčiv (viz dříve)
- potraviny, pitná voda, rekreační voda, vnější ovzduší, pracovní
ovzduší, hlučnost … (+léčiva)
- zdravotní péče (vyšetření, analýzy … správná lékařská praxe)
• Zajištění kvality = Autority– Ministerstva (MZe, MZd, MŽP) a
zřizované ústavy (řada překryvů v kompetencích)
– Státní zdravotní ústav
– Zdravotní ústavy (zpr. krajské)
– Hygienické stanice
– Státní veterinární správa
www.mzcr.cz
Krajské hygienické stanice (www.khsbrno.cz)
www.szu.cz
Zdravotní ústavy (příspěvkové organizace) – např. www.zubrno.cz
Státní veterinární správa
krajské veterinární správy (dozorující orgány jako KHS)
Státní veterinární ústav (příspěvková organizace MZe)
GLP v biologii 2 – zdraví člověka
• Pro každou kategorii, tj.:
– Potraviny, Pitná voda, Rekreační voda, Ovzduší
– Zdravotní péče
definovány různé požadavky na kvalitu
• Chemické rozbory - limity pro vybrané toxické látky (různé druhy potravin,
různé limity): toxické kovy – př. Hg, toxiny plísní, persistentní látky
(polychlorované bifenyly, dioxiny), pesticidy, nepovolené náhražky
• Mikrobiologická bezpečnost (kultivace nebo jiný průkaz patogenů - např.
metody molekulární biologie - Listerie)
• Specifické požadavky (např. prašnost – např. limity pro PM10 = particulate
matter >10micrometrů, hlučnost …)
• Lékařská vyšetření a analýzy (např. průkaz rakovinných biomarkerů,
těhotenství, přítomnost HIV …)
GLP v biologii 2 – zdraví člověka
• Pro každou kategorii, tj.:
– Potraviny, Pitná voda, Rekreační voda, Ovzduší
– Zdravotní péče
definovány různé požadavky na kvalitu
• Chemické rozbory - limity pro vybrané toxické látky (různé druhy potravin, různé
limity): toxické kovy – př. Hg, toxiny plísní, persistentní látky (polychlorované
bifenyly, dioxiny), pesticidy, nepovolené náhražky
• Mikrobiologická bezpečnost (kultivace nebo jiný průkaz patogenů - např. metody
molekulární biologie - Listerie)
• Specifické požadavky (např. prašnost – např. limity pro PM10 = particulate matter
>10micrometrů, hlučnost …)
• Lékařská vyšetření a analýzy (např. průkaz rakovinných biomarkerů, těhotenství,
přítomnost HIV …)
GLP v biologii 2 – zdraví člověka
• Ten sleduje kvalitu (odpovědnost)
– výrobci (voda, potraviny…), ale i prodejci
– zdroje potenciálního znečištění (průmysl, čistírny Odp.
vod …)
– ale i běžný občan, NGO …
• Musí (může) objednávat požadované rozbory:
– Zajištění rozborů
• akreditované laboratoře
– Soukromé laboratoře
– Státní zdravotní ústav, Zdravotní ústavy, Veterinární ústavy …
GLP v biologii 3
Využití obratlovců jako modelů v biologii
GLP v biologii 3 – MODELY v biologii
• Existuje mnoho přístupů v biologii
(řada musí být využívána při hodnocení
„bezpečnosti“ pro zdraví člověka – viz předchozí
diskuze – léčiva, bezpečnost chemických látek …)
• Obratlovci:
– in vivo (zvířata)
– ex vivo (orgány zvířat)
– in vitro (buňky, buněčné linie)
• Bezobratlí
• Rostliny
• Bakterie
Využití zvířat (=obratlovců)
– zvláštní případ (etické aspekty…)
• Právní rámec – nutnost regulace
– Zákon na ochranu zvířat proti týrání 246/1992
– Vyhláška 311/1997 (o využití pokusných zvířat)
• Odpovědný úřad
– Ministerstvo zemědělství a jeho Ústřední komise
pro ochranu zvířat
www.eAGRI.cz (dříve www.mze.cz)
Využití zvířat (=obratlovců)
– zvláštní případ (etické aspekty…)
• Zákon 246/1992 a Vyhláška 311/1997 definují
– CO je zvíře = jen OBRATLOVEC (kromě embryí a plodu)
• typy zvířat, laboratorní / pokusné ...
– KDO smí zvířata využívat
• Vyžaduje se registrace ÚKOZ (MZe)
• Etické komise jednotlivých pracovišť
– (mimo jiné) KDY se smí zvířata využívat pro pokusy
• Ochrana zdraví člověka a prostředí
• Výuka tam, kde je to nezbytné
– JAK lze experimenty realizovat (dodržování pravidel GLP)
• Zdůvodnění využití zvířat (musí být schváleno etickou komisí)
• projekt pokusu, protokol pokusu, evidence
Význam využití zvířat (obratlovců,
savců / pokusných zvířat)
• Unikátní 3D prostorové uspořádání
• Fyziologické a Farmako(Toxo)kinetické procesy (podobné s
člověkem)
• Lze pozorovat komplexní účinky (podobné s člověkem)
• Mnoho látek má více mechanismů toxického efektu
• Z těchto a dalších důvodů - nutno testovat in vivo
– Účinnost léčiv (vč. Vedlejších účinků)
– Bezpečnost kosmetických přípravků
– Toxicita chemických látek pro člověka
LEGISLATIVA EU
„REACH“
Zákon stanoví kdy lze pokusných zvířat využít
– výroba, vývoj, kontrola kvality, nezávadnosti a účinnosti
léčiv, biopreparátů, potravin a event. jiných výrobků
– studium nemocí, prevence, diagnostika, léčení
– studium fyziologických procesů
– ochrana životního prostředí
– výuka na SŠ a VŠ
Zákon stanoví - kdy se zkoušení vyžaduje
OCHRANA ČLOVĚKA a HOSP. ZVÍŘAT
potraviny, zemědělské látky
kontrola léčiv
výroba léčiv - farmakologické preklinické studie
farmakokinetika
nežádoucí účinky
toxicita (akutní, chronická)
mutagenita, kancerogenita
reprodukční toxicita
GLP 4
Bezpečnost chemických látek - úvod
Jsou nebezpečné/toxické látky
regulovány ?
• Do nedávna – neexistovala povinnost průmyslu
prokazovat bezpečnost chemikálií
• Existovala řada různých (často protichůdných)
regulací
• Současnost
– EU = sjednocení – nová legislativa REACH
– USA, Japonsko, Canada atd. – podobný vývoj
• Pro zvláštní případy stále existují specifické
direktivy (např. pesticidy …)
REGULACE chem. látek v EU
• Evropská unie - ECHA (European Chemical Agency)
• REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of
Chemicals)
EU toekomst: REACH
REACH (Registration, Evaluation and
Authorisation of Chemicals)
• Všechny chemikálie vyráběné nebo dovážené do EU
musí být registrovány, zhodnoceny (testovány) a
autorizovány (náklady nese průmysl)
• Hodnocení rizik – cca 30000 chemikálií
– harmonogram dle důležitosti (nejdříve HVP - High Volume
Production chemicals > 1000 t/rok, postupně ostatní
• Hodnocené parametry
– Fyz.chemi. vlastnosti + degradabilita, persistence
– Toxicita pro člověka
– Nebezpečnost pro prostředí - ekotoxicita
REACH EU - předp. počty testovaných chemikálií
REACH EU
předp. náklady na testování
GLP 4
Bezpečnost chemických látek pro
člověka
(toxicita, karcinogenita / lab. zvířata)
Které látky jsou toxické ?
• Každá látka je toxická, záleží jen na DÁVCE a
DOBĚ PODÁNÍ (expozice)
– Krátkodobá (akutní) expozice
-> akutní rychlé účinky (smrt)
– Dlouhodobá (chronická) expozice
-> problematičtější efekty (nemoci, nádory, imunotoxicita,
reprodukční toxicita …)
• Hodnocení a srovnání toxicity:
– nejč. LD50 (letální dávka 50) – dávka, která s největší
pravděpodobností způsobí smrt 50% exponovaných jedinců
(vyjádření jako koncentrace – např. mg/kg živé váhy)
– další parametry „bezpečnosti“ – např. TDI –tolerovatelný
denní příjem (např. mg/kg živé váhy/den)
AKUTNÍ TOXICITA
perorální podání – lab. zvíře:potkan
CHRONICKÁ TOXICITA
• Vyšetření méně specifických efektů při dlouhodobém (opakovaném) podávání
• Dávky pro testování se odvozují z akutní toxicity
(nejvyšší koncentrace odpovídající LD50, dále 10x a 50x nižší)
• Délka studie závisí na „předpokládaném“ schématu podávání látky
• př. Léčivo
předpokládané podávání délka studie
• 1-2 d/wk 2 wks
• 1,2,3 ...7 d 4 wks
• Opak 1-30 d 4 months
• Opak > 30 d 6 months
• Složitý design a řada požadavků
– Zvířata (více druhů, stáří, pohlaví…), počty ve skupině
• Vyhodnocení - pitva (definované úkony), statistika …
• Ekonomická náročnost , etické problémy … GLP!
REPRODUKČNÍ TOXICITA
• Zjišťuje se vliv na
– sexuální chování zvířat
– prenatální mortalitu
– fetální abnormality & poškození během života
• Experimenty
– změny fertility, vliv na F a M gamety (poměry narozených
F a M); toxicita pro embrya a féty, změny gravidity
ovlivňující fety, vliv na růst a vývoj dělohy a placenty,
porod, postnatální vývoj a laktaci matky, vliv na potomstvo
(schopnost učení)
• Složitý design a náročné vyhodnocení
– viz chronická toxicita
HODNOCENÍ KANCEROGENITY
• Mutagenní a genotoxické látky – zpravidla považovány za
karcinogenní
– Rakovina – velký problém pro západní civilizaci
– Oproti jiným toxickým látkám - karcinogeny jsou považovány za
„bezprahově působící“
• Neexistuje bezpečná dávka (i jedna molekula může vyvolat efekt)
• Experimentální průkaz karcinogenity – nejnáročnější studie
(celoživotní expozice, stovky zvířat v experimentu …)
– POZOR - ne vždy však existují korelace výsledků - zvíře vs. člověk (!)
• Řada klasifikačních schémat chemických látek
– WHO (Světová zdravotnická organizace)
– IARC - Intern. Agency for Research of Cancer
http://www.iarc.fr
KLASIFIKACE IARC
• Group 1: The agent (mixture) is carcinogenic to humans.
• Group 2
– Group 2A: The agent (mixture) is probably carcinogenic to humans.
– Group 2B: The agent (mixture) is possibly carcinogenic to humans.
• Group 3: The agent (mixture or exposure circumstance) is not
classifiable as to its carcinogenicity to humans.
• Group 4: The agent (mixture) is probably not carcinogenic to
humans.
Group 1 (Carcinogenic to humans) Group 2A (Probably carcinogenic)
Příklad
Karcinogenita cytostatických (protinádorových) léčiv
Risk / Benefit analýza využití jako léčiva
GLP 5
Bezpečnost chemických látek pro
prostředí
= ekotoxikologie
Ekotoxikologie
• Věda s řadou aplikací, jejímž cílem je racionálně chránit EKOSYSTÉM,
populace a společenstva organismů
(na rozdíl o toxikologie – předmětem je ochrana jednoho druhu = člověk)
• Ekosystém – složitá struktura a funkce bioty
• Nutná je ochrana všech stupňů (trofické úrovně)
– Producenti (řasy, rostliny …)
– Konzumenti různých řádů (bezobratlí, obratlovci)
– Destruenti (mikroorganismy)
• Nelze otestovat účinky na všechny druhy
– existují „modely“ = zástupci významných skupin (trofických stupňů)
• Hodnocení ekotoxicity – podobné principy jako toxikologie
– LC50 (letální koncentrace 50), EC50 (efektivní koncentrace 50 – např. reprodukční
toxicita)
- NOEC – bezpečná hladina („no observed effect concentration“
Rovnováha ekosystému a
význam potravních sítí
Řasové testy toxicity
Řasy
Selenastrum capricornutum
Scenendesmus subcapitatus
Sc. quadricauda
Chlorella vulgaris
Příklady modelů hodnocení – Ekotoxikologické biotesty
Producenti
- ve vodě
- v půdním prostředí
Toxicita pro rostliny (terestrický ekosystém)
- zástupci jednoděložných i dvouděložných (užívá se více druhů)
Daphnia magna
Artemia salina
Ceriodaphnia dubia
Gammarus Chironomus riparius
Příklady - Ekotoxikologické biotesty
Konzumenti – bezobratlí – vodní prostředí
Živorodka duhová (Paví očko), Poecilia reticulata Zebřička - Danio rerio (syn. Brachydanio rerio)
Karas (zlatá forma) Střevle - Pimephales promelas
Pstruh
Příklady - Ekotoxikologické biotesty
Konzumenti – obratlovci – vodní prostředí
Experimentální uspořádání
– testování ekotoxicity ve vodním prostředí
BAKTERIE – významný model v
testování
• Snadná kultivace, krátký generační čas, jednoduché uspořádání
(jediná membrána), jednoduchý genetický aparát
• Využití při testování „bezpečnosti“ látek (i jiných vzorků – extrakty
z potravin …)
– rychlé (skreeningové) testy akutní toxicity (MICROTOX)
– Testy na genotoxicitu - jednoduché sledování poškození DNA:
Amesův test
TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX
- mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri
- krátkodobá expozice testované látce (5-30 min)
- sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě
- uspořádání:
kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru
Mikrobiální ekotoxikologické biotesty
- Test na reverzní mutace se Salmonella typhimurium
-Původní kmen neroste na živném médiu
- Látka vyvolá (reverzní) mutaci -> bakterie rostou
Amesův test
Jaké testy se reálně užívají?
Existují alternativy k in vivo testům ?
Standardizace v biologii
vs. alternativy
Standardní metody
• V odborné literatuře … velké množství experimentálních metod
• Méně metod je standardizovaných a validovaných:
• STANDARDIZACE metod – výsledky akceptovatelné mezi státy –
snižování nákladů / omezení opakovaných hodnocení
• Přejímání standardizovaných metod do legislativ
– např. ČR – Vyhl. 433/2004 Sb.
– Metody testování toxicity (vychází z OECD guidelines – viz příklad zákon !)
• Standardizační agentury:
OECD.org (! Velký význam – viz úvod do GLP/chemie)
ISO.org (spíše Evropský dopad)
ASTM.org (USA)
5 hlavních sekcí OECD GUIDELINES
– v rámci každé „standardizované postupy“
Section 1: Physical Chemical Properties
Section 2: Effects on Biotic Systems (16 postupů)
Section 3: Degradation and Accumulation (8 postupů)
Section 4: Health Effects (86 postupů)
Section 5: Special Activities
OECD GUIDELINES – Chemicals Testing
www.oecd.org
http://www.oecd.org
Příklady – OECD Guidelines – sekce „2“ Effects on biotic systems
(2010 - celkem 33 návodů)
Příklady – OECD Guidelines – sekce „3“
Příklady – OECD Guidelines – sekce „4“
– Toxicita pro člověka – celkem 86 postupů (příklady dole)
- Standardní postupy - akutní, chronickou, reprod. toxicita (viz dříve)
Možnosti využití různých modelů v biologii
– Obratlovci – tj. in vivo (celá zvířata)
• Řada etických a praktických (finančních) limitací
– Náhrada in vivo experimentů - koncept "3R"
• Reduction (Snižování),
• Refinement (Zmírňování),
• Replacement (Nahrazování)
– Alternativní metody
• ex vivo (orgány zvířat)
• in vitro (buňky, buněčné linie, enzymy …)
Výhody alternativních metod
– snižování počtů zvířat
– mechanistické metody ("dioxinová" toxicita)
– rychlejší, levnější, možnost hodnocení více vzorků
Alternativní metody
• Mezinárodní agentury pro validaci alternativních
postupů (cílem je „3R“)
– ICVAM (USA)
– EU: ecvam.jrc.it
• ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods)
• Časopis ATLA (Alternatives to Laboratory Animals)
• Kompletní návody na validované postupy (tedy
ověřené), které splňují 3R, ale nejsou zatím
registrovány standardizačními agenturami
http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/
http://iccvam.niehs.nih.gov/
Příklad – validovaná in vitro technika hodnocení embryotoxicita
in vitro buněčné techniky
další příklady - "alternativní"
techniky (dle ECVAM)
• Embrya a plody
(ze zákona nejsou považovány za „zvíře“)
– CHEST Chick Embryotoxicity Screening Test
– FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay
Xenopus (validovaná alternativa testů teratogenity)
CHEST test
- Injekce testované látky
do vyvíjejícího se vajíčka
Hodnocení malformací
FETAX test
- Hormonální stimulace žab X. laevis
vajíčka
- Expozice oplozených vajíček
- 96 hodin kompletní vývoj embrya
Příklad – vliv herbicidu – paraquat
Kontrolní embryo Malformace páteře
Problematika regulace
Geneticky Modifikovaných
Organismů (GMO)
GMO v ČR
• Zákon 153/2000
• Vyhlášky 372, 373, 374/2000 MŽP
• Definice:
– Organismus
• biologická jednotka (buněčná nebo nebuněčná) schopná
rozmnožování nebo přenosu dědič. materiálu včetně virů
....
– GMO
• organismus (kromě člověka) změněný gen. modifikací
Genetická modifikace - zákon
• Co je Genetická modifikace: ?
– rekombinantní techniky vytvářející nové kombinace DNA - vložení
nového úseku jakýmkoliv způsobem do NK, plazmidu, vektoru ...
– techniky zavádějící děd. materiál připravený mimo organismus do
organismu (mikroinjekce, mikroenkapsulace ...)
– techniky buněčné fúze, hybridizace buněk (!produkce monoklonálních
protilátek)
• Co není Genetická modifikace?
– oplození in vitro
– bakteriální konjugace a všechny podobné přirozené procesy
– indukce polyploidie a haploidie
– mutageneze
– křížení
Proč regulovat GMO ?
• Předběžná opatrnost
– stále málo prostudováno
– neznáme možné důsledky vnášení do prostředí,
například:
• přímé nebo nepřímé škodlivé působení na člověka,
zvířata, rostliny
» onemocnění (GM bakterie)
» alergizace, toxicita
• vliv na dynamiku populací a genetickou rozmanitost
• omezení možnosti léčby (rezistence vůči ATB)
• účinky na biogeochemické procesy (fixace dusíku,
koloběh uhlíku ...)
Příklad
– GM kukuřice s geny pro „Bt“ toxin z Bacillus thuringiensis
- Toxiny působí proti škůdcům
(? Působení toxinů z opadaných listů na biotu v půdě/vodě)
Regulace GMO v ČR
• Hlavní orgán: Ministerstvo ŽP, které registruje:
– seznamy uživatelů (právnické osoby)
– seznamy GMO
• pro uzavřené nakládání
• pro vnášení do prostředí (experimentální hodnocení v prostředí)
• pro vnášení do oběhu (povoleno pro obchodování)
• Další orgány
– ČIŽP, celní orgány, orgány veterinární správy, ÚKSÚZ,
SZÚ, ÚSKVBL, ČZPI
Povinnosti uživatele GMO
• REGISTRACE
– Složitá forma žádosti - řada požadavků (př. přesná
definice genetické změny pro účely identifikace…)
– Pověřené osoby (vzdělání, praxe ...)
– Odborný poradce
• Před zápisem do seznamu je nutné provedení
analýzy rizika a kategorizace konkrétního
GMO - popis náležitostí je ve vyhlášce
Analýza rizika GMO - 4 kategorie
• A - bez rizika nebo s min. rizikem škodlivého působení
• B - riziko, které může být odstraněno obecně známými
opatřeními
• C - riziko, které může být odstraněno jen zvláštními náročnými
zásahy
• D - riziko, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela
odstraněno
• Podle kategorie rizika je nutno zabezpečit provoz zařízení
– vybavení
– provozní řád (režim SLP)
• identifikace, osoby, seznam a popis pracovních postupů, výčet GMO a
jejich počet, zásady vedení evidence o provádění sanitace, hygiena, vedení
dokumentace ...
• opatření pro případ havárie - speciální havarijní plán
Nakládání s GMO – důkladná
dokumentace (SLP režim)
• PLÁN ETAPY
– účel, údaje o organismu, osoby, specifikace materiálu, postupy
nakládání, likvidace, odpady
– schválení odborným poradcem
• Provozní deník (každý zápis s podpisem)
– plán etapy, průběh etapy
– primární údaje (!)
– zápisy o kontrolách
• Závěrečná zpráva etapy
• Průběžná archivace a reporting -> MŽP