2. Srovnání postupů izolace DNA – kolonky vs. paramagnetické částice A) Izolace DNA na kolonkách Izolace DNA z jakéhokoliv materiálu je dnes základním postupem v laboratořích zabývajících se molekulárně-biologickými metodami. Izolace DNA je prováděna nejen v klinických laboratořích, ale například také v laboratořích veterinárních, potravinářských (např. testování GMO) a zemědělských. Nejvíce DNA analýz je v současné době prováděno v rámci lékařského výzkumu a v rámci klinické DNA diagnostiky. Proto se budeme ve většině dalších metodik v rámci Cvičení z DNA diagnostiky držet postupů používaných v klinických laboratořích. Při DNA diagnostice je dnes využíváno především metody řetězové polymerázové reakce v podobě běžné PCR, nested PCR nebo RealTime PCR. Pro metodu PCR je třeba čisté a nefragmentované DNA o určené koncentraci. Při izolaci DNA je třeba z klinického materiálu odstranit veškeré inhibitory PCR reakce, kterými jsou například hemoglobin a další proteiny, antibiotika, polysacharidy atd. Za účelem izolace DNA bylo vypracováno nespočet metod, nicméně v klinických provozech je z důvodu urychlení práce, standardizace práce, standardizace čistoty a výtěžků používáno komerčně dostupných izolačních metod. Mezi nejčastěji používané izolační principy patří izolace na kolonkách a pomocí paramagnetických částic. Izolace na kolonkách je založena na principu selektivní vazby DNA a/nebo RNA o určité délce na vrstvu drceného borosilikátového skla, která se nachází mezi dvěma fritami na kolonce. K vazbě dochází v přítomnosti tzv. chaotropní soli, která vytěsňuje z molekul DNA/RNA molekuly vody čímž potlačuje jiné než iontové interakce a v přítomnosti asi 10% isopropanolu nebo etanolu, který DNA/RNA částečně vysráží. Mezi tzv. chaotropní soli patří například guanidin hydrochlorid, který potlačuje vodíkové vazby a hydrofobní interakce uvnitř molekul DNA/RNA a nebo proteinů. V rámci cvičení z DNA diagnostiky bude použit kit určený především k izolaci genomové DNA z 200 µl plné krve. Ve cvičení se nebude pracovat s lidskou krví. Krev bude nahrazena stěrem z ústní sliznice. Ústní sliznice obsahuje velké množství živých buněk, které lze snadno a bezbolestně setřít sterilním tampónem. Stěr z ústní sliznice si provede každý student sám. Ke stěru bude použit sterilní odběrový tampón. Izolovaná DNA poslouží dále jednak ke srovnání výtěžku a čistoty s DNA izolovanou dalšími metodami, jednak poslouží k PCR analýze. Obsah kitu NucleoSpin Blood QuickPure (firma MACHEREY – NAGEL) - proteináza K - roztok BQ1 – lyzační - roztok BQ2 – promývací - roztok BE – eluční kolonky ve 2 ml mikrozkumavkách - mikrozkumavky o objemu 2 ml Upozornění Při práci vždy používejte rukavice. Veškerý materiál v laboratoři nutno považovat jako potenciálně infekční. Vyhněte se kontaktu reagencií s kůží. V případě kontaktu potřísněné místo omyjte důkladně vodou. Vyvarujte se požití součástí kitu. Reagencie označené jako hořlavé musejí být drženy v dostatečné vzdálenosti od otevřeného plamene nebo ohně. Odběr vzorku 1. Nejméně 60 minut před odběrem nejezte a nepijte, výjimkou je pouze neslazená nesycená voda. 2. Před odebráním vzorku si umyjte ruce, vypláchněte si ústa čistou neperlivou vodou a polkněte případný zbytek slin nebo vody v ústech. 3. Vyjměte odběrový tampón ze zkumavky. 4. Štětičkou otírejte sliznice obou tváří včetně záhybů mezi dásněmi a vnitřní stranou tváří, a to pohybem dopředu a dozadu (jako při čištění zubů) a zároveň štětičkou otáčejte, aby byla využita její celá plocha. Ideální tlak je dosažen v okamžiku, kdy na vnější tváři ucítíte tlak zevnitř. Jednou štětičkou otírejte sliznice tváří přibližně po dobu 1 minuty. Pokud se vám v průběhu stěru tvoří sliny, polkněte je (setřít sliny je nežádoucí!). 5. Po odběru umístěte odběrový tampón do kelímku štětičkou nahoru a přistoupíte k izolaci DNA. Štětička odběrového tampónu nesmí za žádných okolností přijít do styku s ničím jiným než se sliznicí, z níž se vzorek odebírá!!! Postup izolace DNA: Po celou dobu používejte ochranné rukavice! 1. Do mikrozkumavky nepipetujte 20 µl proteinázy K a 400 µl roztoku BQ1. 2. Stěrovku vložte do připravené mikrozkumavky a sterilními nůžkami odstřihněte štěteček – stříhejte zhruba 0,5 cm nad štětečkem, zvortexujte. 3. Nastavte třepání na 700 rpm a inkubujte 10 minut při 70°C. 4. Sterilní pinzetou vyjměte štěteček a vyhoďte. 5. Přidejte 400 µl etanolu a zvortexujte. 6. Krátce centrifugujte, abyste odstranili kapky z víčka mikrozkumavky. 7. Přeneste veškerý obsah mikrozkumavky do kolonky. 8. Centrifugujte 1 minutu při 14 000 x g. 9. Přeneste kolonku do nové mikrozkumavky, přidejte 200 µl roztoku BQ2. 10. Centrifugujte 1 minutu při 14 000 x g . 11. Vylijte supernatant do odpadu a vraťte kolonku do mikrozkumavky, přidejte 350 µl BQ2. 12. Centrifugujte 3 minuty při 14 000 x g. 13. Přeneste kolonku do nové mikrozkumavky a přidejte 50 µl elučního roztoku BE. Inkubujte 1 minutu při pokojové teplotě. 14. Centrifugujte 1 minutu při 14 000 x g. 15. Odstraňte kolonku a zavřete víčko mikrozkumavky. Genomová DNA je nyní připravena pro různé aplikace. 16. Změřte koncentraci vyizolované DNA na Spektrofotometru. Izolační kit UltraClean™ Blood Spin DNA - proteináza K - roztok B1 – lyzační - roztok B2 – ethanol - roztok B3 – promývací - roztok B4 – promývací - roztok B5 – eluční kolonky ve 2 ml mikrozkumavkách - mikrozkumavky o objemu 2 ml Postup izolace DNA: Po celou dobu používejte ochranné rukavice! 1. Do připravených mikrozkumavek napipetujte 400 µl roztoku TD1 (B1) a 20 µl proteinázy K. 2. Stěrovku vložte do označené mikrozkumavky a sterilními nůžkami odstřihněte štěteček. 3. Mikrozkumavky vložíme do termotřepačky (Biosan) vytemperované na 56°C. Nastavte třepání na 600 rpm a inkubujte 20 min. Poté mikrozkumavky krátce stočte na centrifuze. 4. Sterilní pinzetou vyjměte štěteček a vyhoďte. Ke každému lyzátu přidejte 400 µl roztoku B2. Jemně zvortexujte a zcentrifugujte. 5. Přeneste veškerý obsah mikrozkumavky do kolonky. 6. Centrifugujte 1 min při 13 000 x g. 7. Přendejte kolonku do nové mikrozkumavky. 8. Do kolonky přidejte 500 µl roztoku B3. 9. Centrifugujte 30 sekund při 13 000 x g. 10. Vyjměte kolonku z mikrozkumvaky, obsah mikrozkumavky vylijte do odpadu a vraťte do ní kolonku. 11. Do kolonky přidejte 500 µl roztoku B4. 12. Centrifugujte 30 sekund při 13 000 x g . 13. Vyjměte kolonku z mikrozkumavky, obsah mikrozkumavky vylijte do odpadu a vraťte do ní kolonku. 14. Znovu centrifugujte 30 sekund při 13 000 x g. 15. Opatrně vyjměte kolonku a přeneste ji do nové mikrozkumavky, aniž byste se dotkli roztoku B4 na dně původní mikrozkumavky. 16. Roztok B5 inkubujte asi 5 minut na vodní lázni (termotřepačce) při 65°C. do středu kolonky nepipetujte 100 µl roztoku B5 předehřátého na 65°C. 17. Centrifugujte 1 min ři 13 000 x g. 18. Odstraňte kolonku a zavřete víčko mikrozkumavky. Genomická DNA je nyní připravena pro různé aplikace. B) Izolace DNA pomocí paramagnetických částic Jedna z metod izolace nukleových kyselin, která se více rozšířila, využívá tzv. (para)magnetické částice (MPs). MPs jsou částice o velikosti 5 nm–100 μm tvořené z kovového jádra, tím bývá nejčastěji gamma-Fe[2]O[3] (maghemit) nebo Fe[3]O[4] (magnetit), ale i například Au. Jádro obaluje vrstva, která má připravený specifický povrch. Ten lze upravit podle toho, jaké molekuly chceme z daného materiálu izolovat. Samotná velikost MPs se dá přizpůsobit podle toho, co izolujeme: 5–50 nm proteiny; 20–450 nm nukleové kyseliny, viry; 10–100 μm buňky. Princip izolace je založen na fyzikálně-chemických vlastnostech MPs. Ty reagují na vnější magnetické pole a jsou schopny navázat různé bioreaktivní molekuly, díky jejich afinitě k modifikovanému povrchu přímo z biologického materiálu. Při samotné izolaci se pak MPs se přidají ke vzorku, kde na sebe naváží cílené molekuly. Modifikované MPs se následně přitáhnou magnetem ke stěně zkumavky a zbylý roztok s nenavázanými, jinak běžně interferujícími látkami, se odstraní. Následuje promývání a konečné uvolnění MPs i s navázanými molekulami do námi přidaného roztoku. Různým fyzikálně-chemickým krokem (denaturace) se oddělí navázané molekuly od MPs. Tím získáme cílené molekuly a můžeme s nimi dál pracovat. Obsah kitu Chemagic DNA Blood 100 Kit (firma CHEMAGEN) - Magnetické kuličky (Magnetic Beads) - Lyzační pufr (Lysis Buffer 1) - DNA-vazebný pufr (DNA Binding Buffer 2) - Promývací pufr (Wash Buffer 3) - Promývací pufr (Wash Buffer 4) - Promývací pufr (Wash Buffer 5) - Eluční pufr (Elution Buffer 6), tj. 10 mM Tris-HCl pH 8.0 nebo lze použít TE pufr pH 8.0 Proteináza K (koncentrace 10 mg/ml) Mikrozkumavky o objemu 2 ml Upozornění Při práci vždy používejte rukavice. Veškerý materiál v laboratoři nutno považovat jako potenciálně infekční. Vyhněte se kontaktu reagencií s kůží. V případě kontaktu potřísněné místo omyjte důkladně vodou. Vyvarujte se požití součástí kitu. Reagencie označené jako hořlavé musejí být drženy v dostatečné vzdálenosti od otevřeného plamene nebo ohně. Odběr vzorku – viz. výše Postup izolace DNA: Po celou dobu používejte ochranné rukavice! 1. Do 2 ml zkumavky napipetujte 100 ul PCR H[2]O 125 ul Lysis Bufferu 1 a přidejte 20 ul proteinázy K. 2. Stěrovku vložte do připravené a označené 2 ml zkumavky a sterilními nůžkami odstřihněte štěteček – stříhejte zhruba 0,5 cm nad štětečkem. 3. Zkumavku vložte do termo třepačky vytemperované na 56°C. Nastavte třepání na 600 rpm. Inkubujte 20 minut. Poté zkumavku krátce stočte na centrifuze. 4. Sterilní pinzetou vyjměte štěteček a vyhoďte. K lyzátu přidejte 360 ul Binding Bufferu. Jemně zvortexujte. 5. Ke vzorku přidejte 14 ul magnetických kuliček řádně promíchaných! Několikrát propipetujte a nechte inkubovat 5 minut při pokojové teplotě. 6. Zkumavky umistěte do magnetického stojánku a nechte bez hýbání stát 2 minuty. 7. Aniž byste se zkumavkou pohnuly je otevřete a opatrně pipetou odsajte supernatant. 8. Ke kuličkám přidejte 600 ul Wash Bufferu 3, několikrát propipetujte a umístěte do magnetického stojánku na 1 minutu. 9. Odsajte supernatant a přidejte 600 ul Wash Bufferu 4, několikrát propipetujte a umístěte do magnetického stojánku na 1 minutu. 10. Nechte zkumavky stát v magnetickém stojánku a odpipetujte supernatant. Opatrně po stěně zkumavky připipetujte 1000 ul Wash Bufferu 5. Nepromíchávejte!!! Nechte stát v magnetickém stojánku přesně 90 sekund a důkladně odsajte supernatant. 11. K promytým magnetickým kuličkám přidejte 50 ul Ellution Bufferu 6. Několikrát promíchejte pipetou. 12. Zkumavky nechte inkubovat 10 minut v termotřepačce při teplotě 55°C a otáčkách 600 rpm. 13. Zkumavky krátce stočte a vložte do magnetického stojánku na 2 minuty. Supernatant obsahující DNA odpipetujte do čistých zkumavek (1,5 ml) a stočte na centrifuze při maximálních otáčkách 6 minut. Supernatant odpipetujte do čistých šroubovacích zkumavek. 14. Změřte koncentraci vyizolované DNA na Spektrofotometru.