Detekce polymorfizmu I/D genu pro ACE pomocí PCR Úvod Úloha renin-angiotensinového systému (RAS) byla donedávna zmiňována pouze v souvislosti s regulací krevního tlaku. V posledních letech je velmi často diskutována role RAS v mozku, kde byly nalezeny mRNA pro renin, angiotensinogen i angiotensinkonvertázu. Bylo zjištěno, že angiotensin má mnoho behaviorálních efektů, jako je stimulace žízně a modulace chuti na slané, ovlivňování paměti a učení atd. Byla zjištěna interakce mezi mozkovým RAS a klasickými neurotransmiterovými systémy, jako jsou systém cholinergní, noradrenergní, dopaminový, GABAergní a opioidní. Angiotensinkonvertáza (ACE) je enzym, který konvertuje angiotensin I na angiotensin II, navíc má ještě plno zajímavých funkcí - inaktivuje bradykinin, substanci P, neurotensin a enkefaliny. Bylo zjištěno, že polymorfizmus I/D ACE ovlivňuje plazmatickou hladinu tohoto enzymu tak, že se jeho hladina snižuje od genotypu DD po genotyp II. Do současné doby byly publikovány pouze čtyři studie zabývající se vztahem I/D ACE polymorfizmu k mozkovým funkcím. Arinami et al. (1996) zjistil, že polymorfizmus I/D ACE je jedním z genetických faktorů ovlivňujících interindividuální variabilitu hladiny substance P. Dále zjistil, že tento polymorfizmus může mít vztah k dispozicím k afektivním poruchám. Amouyel et al. (1996) sledoval vliv polymorfizmu I/D ACE na kognitivní funkce a zjistil, že frekvence alely D u genotypu DD byla vyšší u skupiny osob s kognitivní poruchou. Richard et al (2000) potvrdil homozygotní kombinaci alel DD jako rizikový faktor kognitivních poruch. Hollá et al. (1999) studovala I/D ACE polymorfizmus M235T polymorfizmus genu pro angiotensinogen u zdravých osob ve vztahu k typu osobnosti zjišťovaného podle rozšířené Bortnerovy stupnice. Zjistila, že genotyp IIMT má vztah k osobnosti typu A a genotyp DDMT má vztah k osobnosti typu B. Zjistila také prevalenci alely D u osobnosti typu B, který může být charakterizován jako introvertní typ osobnosti. Reagencie PCR mix 12,5 µl F primer 0,5 µl ID-1 (5´ - CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT) R primer 0,5 µl ID-2 (5´ - GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T) voda 10,5 µl vzorek DNA 1,0 µl Amplifikace fragmentů: - Do mikrozkumavky napipetujte 24 μl mixu a 1 μl DNA - Mikrozkumavky vložte do termocykléru. Amplifikace bude probíhat dle následujícího programu: 94°C 2,5 min 94°C 30 sek 59°C 30 sek 30x 72°C 30 sek 72°C 5 min 10°C hold - Amplifikáty poté naneste na připravený 1,5 % agarózový gel v elektroforetické vaně. Vanu připojte ke zdroji elektrického napětí a nechte proběhnout elektroforézu cca 40 minut při 80 V. - Poté vyjměte gel z elektroforetické vany a vložte jej do transiluminátoru ke konečnému vyhodnocení. Příprava agarózového gelu (agaróza, TBE pufr, ethidiumbromid) - vypočítáme objem vany, určené pro elektroforézu (V = a.b.c) - do výsledného objemu připravíme 1,5 % gel př.: V = 150 ml; 150 ml.................100 % x ml (g)................1,5 % -------------------------------- x = 1,5/100 * 150 = 2,25 g Pro přípravu 1,5 % agarózového gelu je potřeba 150 ml TBE pufru a 2,25 g agarózy.