Úloha 5 : Měření aktivity phenylalaninamoniak lyasy
Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 1
Měření aktivity phenylalaninamoniak lyasy
TEORETICKÝ ÚVOD
V rostlinné buňce existují tři základní regulační enzymy účastnící se syntézy fytoalexinů,
phenylalaninamoniak lyasa (PAL), 5-epiaristolochen syntasa (EAS) a
3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductasa (HMGR). Aktivace enzymu PAL (EC: 4.3.1.5) je spojena
s akumulací fenylpropanoidních látek a se syntézou důležité signální molekuly, kyseliny salicylové.
PAL katalyzuje reakci přeměny aminokyseliny L-phenylalaninu na kyselinu trans-skořicovou:
Aktivita PAL se dá velmi dobře měřit nárůstem absorbance kyseliny trans-skořicové při 290 nm.
1. Buchanan B. B., Gruissem W., Jones R. L.: Biochemistry & molecular biology
Literatura
Úloha 5 : Měření aktivity phenylalaninamoniak lyasy
Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 2
POSTUP PRÁCE
Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci z listů po aplikaci cryptogeinu a kontrolních listů po aplikaci
vody sesbíraných v časových intervalech 0h, 6h a 24h po aplikaci.
Izolace enzymu phenylalaninamoniak lyasy
Roztoky:
Izolační pufr (0,1 M Borát (pH= 8.8), 17 mM β−merkaptoethanol, 1 % PVP)
0,3 g tkáně vložte do třecí misky, zmrazte v tekutém dusíku a rozetřete v 1.5 ml izolačního pufru.
Homogenát nepipetujte do 2.0 ml zkumavky. Centrifugujte 20 minut při 15 000 x g při 4o
C. Poté
přepipetujte supernatanty do 1.5 ml zkumavky a uchovávejte na ledu.
Měření aktivity enzymu phenylalaninamoniak lyasy
Roztoky:
0,1M Borátový pufr (pH = 8.8)
12 mM L-Phenylalanine
Měření se bude provádět v triplikátu. Do tří 1.5 ml zkumavek napipetujeme jednotlivé složky
reakční směsi:
0,1M Borátový pufr (8.8) 150 ul
12 mM L-Phenylalanin 150 ul
Jako blank použijeme následující reakční směs:
0,1M Borátový pufr (8.8) 150 ul
12 mM D-Phenylalanin 150 ul
Poté přidejte do každé zkumavky 125 ul enzymového extraktu a inkubujte 30 minut při 30o
C.
Následně reakci zastavíme přídavkem 150 ul 0,1M TCA. Směs důkladně promíchejte na vortexu a
do každé zkumavky přidejte 125 ul vody a směs centrifugujte 10 minut při 15 000 x g. Odsajte
supernatant, přepipetujte ho do UV semi-mikro kyvety a změřte absorbanci při 290 nm oproti
blanku (reakční směs s D-phenylalaninem).
3x
1x
Úloha 5 : Měření aktivity phenylalaninamoniak lyasy
Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 3
VYHODNOCENÍ
-Spočítejte aktivitu PAL v čase 0h, 6h a 24h po aplikaci cryptogeinu a kontrolního vzorku (vody).
-Výsledky vyneste do grafu, kde budou srovnány změny aktivity PAL po aplikaci cryptogeinu ve
srovnání s kontrolou (voda) v závislosti na čase.
-Výsledek zdůvodněte.