Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS‐PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009)      1  Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci  SDS‐PAGE a Western blot analýzy      TEORETICKÝ ÚVOD    SDS‐PAGE  je  velmi  efektivní  analytická  pomůcka  pro  separaci  proteinové  směsi,  k analýze  čistoty  proteinu  a  jeho  přibližné  molekulové  hmotnosti,  ale  neposkytuje  nám  žádná  data na  základě, kterých  bychom  mohli  provést  identifikaci  nabarveného  proteinu.  Barvení  stříbrem  nebo  coomasie  nám  poskytuje  pouze  důkaz  o  přítomnosti  molekulové  hmotnosti proteinu. Při provádění podrobnějších analýz separovaných proteinů se obvykle  setkáváme s problémem málo přístupné a husté matrice polyakrylamidového gelu pro celou  řadu detekčních činidel. Proteiny z SDS‐PAGE gelu tak mohou být přeneseny (přeblotovány)  z gelu  na  tenkou  matrici  (blotovací  membránu),  na  které  jsou  daleko  více  přístupné  pro  chemická  činidla  nebo  biochemické  reagencie.  Pokud  je  přenos  proteinů  spojen  s vysoce  specifickou  a  citlivou  detekcí  pomocí  imunometod,  je  tento  proces  nazýván  Western‐ Blottingem.  Western  blotting  má  celou  řadu  výhod  zahrnující  malou  spotřebu  reagencií,  krátký čas zpracování, nenáročné vybavení a velmi vysokou efektivitu.   V současné  době  se  používají  tři  základní  blotovací  matrice:  nitrocelulosová,  nylonová  a  PVDF  (polyvinyldifluoridová).  Vazba  proteinů  na metrice  je ne‐kovalentní,  kdy  k nejsilnější interakci dochází u PVDF membrány. Ze všech typů membrán se potom PVDF  membrána  vyznačuje  největší  pevností  a  velmi  nízkým  pozadím  při  barvení.  Pro  přenos  proteinů  z gelu  na  membránu  využijeme  metodu  semi‐dry  elektroblottingu,  kdy  je  gel  s membránou  umístěn  mezi  dvě  elektrody  a  dochází  k přenosu  proteinů  pomocí  aplikovaného  elektrického  pole.  K vlastní  detekci  proteinů  na  membráně  se  při  imunodetekci  používají  většinou  dvě  protilátky.  Primární  protilátka  je  specifická  pro  náš  protein  zájmu.  Druhá,  sekundární,  protilátka  je  většinou  protilátka  proti  IgG    protilátce  použité v prvním kroku a je konjugována s enzymem, nejčastěji křenovou peroxidasou nebo  alkalickou fosfatasou. Pokud se poté přidá k membráně detekční roztok, enzym konjugovaný  se  sekundární  protilátkou  katalyzuje  barevnou  reakci  dávající  barevný  proužek  na  membráně.  V našem případě budou použity dvě varianty detekce.   První  varianta  bude  levnější  možností  detekce,  kdy  specifická  skupina  proteinů,  glykoproteiny,  bude  identifikována  pomocí  lektinů,  které  se  specificky  váží  na  cukerné  zbytky. Lektiny jsou třídou proteinů vyskytujících se u bakerií a rostlin schopné vázat se na  cukerné zbytky glykoproteinů. V našem experimentu použijeme lektin z fazole Konkavalin A  (Con  A),  který  má  velmi  vysokou  afinit  k a‐D‐manosylovým  zbytkům.  Tento  Con  A  je  konugován  s křenovou  peroxidasou,  která  poskytne  po  přidání  substrátu  4‐chloro‐1‐ naftolu/peroxidu vodíku barvenou reakci.   Při druhé variantě bude použita polyklonální protilátka proti lidským IgG protilátkám  (specifická k γ‐řetězci) konjugovaná s křenovou peroxidasou.   Jako vzorek bude použito lidské sérum        Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS‐PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009)      2  POSTUP PRÁCE    SDS‐PAGE elektroforéza    Roztoky:  Proteinový marker – 14‐160 kDa  Elektroforetický pufr (25 mM Tris‐Cl, pH 8,3, 150 mM glycin, 0.1%SDS  Nanášecí pufr    1.  Ke  30  ul  vzorku  krevního  séra  přidejte  6  ul  nanášecího  pufru,  promíchejte  a  inkubujte 5 min při 100°C v termostatu  3.  Následně zkumavky zchlaďte na ledu  4.  Poté naneste na 3 gely po 10 ul vzorku a 5 ul hmotnostního markeru  5.  Spusťte elektroforézu, podmínky separace: konstantní proud 30 mA/gel, 40 minut  6.  Po elektroforéze první gel propláchněte 15 minut v MiliQ vodě a následně ponořte  do  50  ml  barvy  koloidní  coomasie  BioSafe,  s druhým  a  třetím  gelem  proveďte  blotting.  7.  Gel  ponořený  do  koloidní  coomasie  po  dvou  hodinách  vyjměte  a  propláchněte  vodou a naskenujte.    Semi‐Dry Blotting    Roztoky:  Přenosový pufr (25 mM Tris‐Cl, pH 8,3, 150 mM glycin, 20 % metanol, 0.1%SDS)        1.  připravte si dvě membrány PVDF a 8 papírů Whatman 3MM o rozměrech 7x5 cm.  2.  Ponořte PVDF membrány na 20 s do MeOH (snížení hydrofobicity membrány) a poté  je inkubujte 5 min v přenosovém pufru společně s 8 papíry Whatman 3MM  3.  Sestavte sandwich dle obrázku níže.  4.  Spusťte semi‐dry elektro transfer. Provádějte přenos 1 h při konstantním napětí 30V   5.  Po skončení blotting vyndejte membrány a ponořte je na 5 min do barvičky Ponceau  S.  6.  Poté je opláchněte ve vodě a pomocí propisky zaznačte marker.                              Wet Blotting  Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS‐PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009)      3    1.  připravte si dvě membrány PVDF a 8 papírů Whatman 3MM o rozměrech 7x5 cm.  2.  Ponořte PVDF membrány na 20 s do MeOH (snížení hydrofobicity membrány) a poté  je inkubujte 5 min v přenosovém pufru společně s 8 papíry Whatman 3MM  3.  Sestavte sandwich dle obrázku níže a umístěte ho do aparatury Mini‐Protean 3.  4.  Provádějte přenos 1 h při konstantním napětí 30V   5.  Po skončení blotting vyndejte membrány a ponořte je na 5 min do barvičky Ponceau  S.  6.  Poté je opláchněte ve vodě a pomocí propisky zaznačte marker.                                  Detekce pomocí Konkavalinu A a Anti‐Human IgG protilátek    Roztoky:  TBST pufr (20 mM Tris‐Cl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 0,1 % Tween‐20)  Con A‐HRP konjugát (1mg/ml)  Roztok DAB  30% peroxid vodíku    Detekce pomocí Konkavalinu A    1.  Nevazebná místa blokujte v 20 ml roztoku 1 x TBST obsahujícím Albumin po dobu 30  minut  2.  Dvakrát membránu promyjte 20 ml 1 x TBST pufru po dobu 5minut  3.  Inkubujte membránu ve 20 ml TBST pufru s 50ul Con A‐HRP konjugátu po dobu 2  hodin.   4.  Dvakrát membránu promyjte 20 ml TBST pufru po dobu 5minut  5.  Ponořte membránu do 20 ml TBS s 0.05% DAB a přidejte 20 ul 30% peroxidu vodíku    6.  Inkubujte  membránu  v  roztoku,  dokud  se  neobjeví  barevné  proužky  –  asi  10‐15  minut  7.  Poté zastavte reakci promytím v Mili‐Q vodě  8.  Naskenujte membránu    Detekce pomocí Anti‐Human IgG protilátek  Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS‐PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009)      4    1.   Neobsazená vazebná místa blokujte v 20 ml roztoku 1 x TBS obsahujícím 5% sušené  mléko (nízkotučné) po dobu 30 minut  2.  Inkubujte membránu ve 20 ml protilátky ředěné TBST pufrem v poměru 1:30000 po  dobu 2 hodin.   3.  Dvakrát membránu promyjte 20 ml TBST pufru po dobu 5minut  5.  Ponořte membránu do 20 ml TBS s 0.05% DAB a přidejte 20 ul 30% peroxidu vodíku    6.  Inkubujte  membránu  v  roztoku,  dokud  se  neobjeví  barevné  proužky  –  asi  10‐15  minut  7.  Poté zastavte reakci promytím v Mili‐Q vodě  8.  Naskenujte membránu         VYHODNOCENÍ    1.  Uveďte výsledek elektroforézy a blottingu (výsledný obarvený gel a membránu)  2.  Na základě hmotnostního markeru sestrojte kalibrační křivku a odečtěte hmostnosti  proteinů detekovaných na membráně.   3.  Popište a zdůvodněte barvení jednotlivých proteinu Konkavalinem A a Anti‐Human  IgG protilátkami.