C7895 Hmotnostní spektrometrie biomolekul Jan Preisler Oddělení analytické chemie Ústavu chemie, A14-312, tel.: 549496629, preisler@chemi.muni.cz. Konzultace dle domluvy v kanceláři. Kurs poskytne základy hmotnostní spektrometrie: přehled ionizačních metod, hmotnostních analyzátorů, vybraných technik a aplikací. Důraz bude kladen na hmotnostní spektrometrii biologických látek (ionizační metody MALDI, ESI), moderní instrumentaci v hmotnostní spektrometrii (TOFMS, iontové pasti, FT-ICR-MS) a nejnovější vývoj v oboru. Plán přednášek pro rok 2010 Přednášky se konají v učebně A14-207 každou středu, 14:00 - 15:50; změny budou ohlášeny předem. Sylabus a časový plán může být ještě mírně upraven v průběhu semestru. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 1 Předběžný plán přednášek pro rok 2007 7. 3. 11. Time-of-Flight hmotnostní spektrometr (TOFMS). Metody zvýšení rozlišení TOF MS (reflektor, zpožděná a ortogonální extrakce). 8. 10. 11. Kolizně indukovaná disociace (CID). Tandemová MS (MS/MS). Další možnosti disociace (ECD, ETD, fragmentace ve zdroji a za zdrojem - ISD a PSD). Techniky TOF-TOF, LIFT. Ion mobility spectrometry (IMS). 9. 17. 11. Detektory a detekční elektronika. Principy vakuové techniky. Spojení separace a hmotnostní spektrometrie: instrumentace (on-line, off-line, čipy) 10. 24. 11. Biologické aplikace MS: proteomika. Separační techniky. Enzymatické štěpení proteinů. Identifikace proteinů: mapování peptidů, sequence tag, accurate mass tag. 11. 3. 12. Aplikace: proteiny a peptidy. Izotopové značení. Metoda ICAT. Stanovení sekvence. Post-translační modifikace. 12. 10. 12. Analýza S-S můstků. Proteiny. MS databáze. DNA, sacharidy, syntetické polymery. 13. 17.12. Konzultační vánoční besídka (s příklady otázek u zkoušek). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 4 Obsah I. Úvod II. Ionizační metody a metody zavádění vzorku III. Hmotnostní analyzátory IV. Biologické aplikace MS V. Otázky Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2 Úvod do hmotnostní spektrometrie: Stručná historie. Přehled metod a instrumentace. Základní koncepty MS (rozlišení, citlivost). Izotopové paterny organických molekul Ionizační metody a metody zavádění vzorku: Ionizace elektronovým nárazem (El) Předběžný plán přednášek pro rok 2007 1. 22. 9. Stručná historie hmotnostní spektrometrie: Přehled metod a instrumentace. Základní koncepty MS (rozlišení, citlivost). Ionizační metody a metody zavádění vzorku: Elektronová ionizace (EI). 2. 29. 9. Chemická ionizace (CI). Doutnavý výboj. Indukčně vázané plazma (ICP). Ionizace rychlými atomy (FAB). Ionizace (SIMS). Fotoionizace (PI). Plazmová Desorpce (PD). 3. 6. 10. Laserová Desorpce (LD). Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI). 4. 13. 10. Termosprej (TS). Ionsprej (IS). Elektrosprej (ES). Analyzátory. Základy iontové optiky. Weinův Filtr. Energetické analyzátory (E). 5. 20. 10. Hmotnostní analyzátory. Magnetický sektor (B). Kvadrupólový filtr (Q). Iontová past (IT). 6. 27. 10. Lineární past (LT). Iontový cyklotron (FT-ICR-MS). Orbitrap. Elektrostatická past. Simion: příklady. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 3 I. Úvod Zdroje informací o hmotnostní spektrometrii Stručná historie hmotnostní spektrometrie, přehled metod a instrumentace Základní koncepty hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 6 1 Studijní materiál Poznámky z přednášek Materiály použité při přednášce lze stáhnout z: http:Wbart.chemi.muni.cz a používat při přednášce. Neexistuje souhrnná česká učebnice nebo skripta moderní hmotností spektrometrie se zaměřením na analýzu biomolekul. Školy hmotnostní spektrometrie a HPLC-MS. Doplňková literatura • Robert J. Cotter: Time-of-Flight Mass Spectrometry - Instrumentation and Applications in Biological Research, American Chemical Society, 1997. • Richard B. Cole et al.: Electrospray Ionization Mass Spectrometry -Fundamentals, Instrumentation & Applications, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 7 Hmotnostní spektrometry Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů, Simion Energetické analyzátory Magnetický sektor Kvadrupólový analyzátor Iontový cyklotron (ICR-FT-MS) Iontová past (IT) Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOFMS) Nové hmotnostní spektrometry: Orbitrap, TOF-TOF, LIFT-TOF. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS, MSn) Kolizně indukovaná disociace (CID) Povrchově indukovaná disociace (SID) Fragmentace ve zdroji (ISF) a mimo zdroj (PSD). Principy vakuové techniky Detektory a detekční elektronika Chromatografie - MS (on-line, off-line, in-line MS) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 10 Další zdroje informací Internet Učebnice http://www.ms-textbook.com/ nebo http://www.spectroscopynow.com/Spy/basehtml/SpyH/1,1181,4-14-9-0-0- education dets-0-68,00.html Souborný zdroj informací www.spectroscopynow.com Protein Prospector prospector.ucsf.edu Komerční společnosti, např. http://www.matrixscience.com/ atd. atd. Specializované časopisy International Journal of Mass Spectrometry Journal of Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry Mass Spectrometry Reviews Rapid Communications in Mass Spectrometry Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Aplikace MS Analýza biologických látek: • Proteiny, mapování peptidů, peptidové databáze, nové metody (ICAT) • Analýza peptidů (disulfidové můstky, post-translační modifikace) • Nukleové kyseliny • Sacharidy Analýza syntetických polymerů A další... Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 8 11 Ionizační metody a metody zavádění vzorku Doutnavý výboj (GD) Elektronová ionizace (EI) Chemická ionizace (CI) Indukčně vázané plazma (ICP) Ionizace rychlými atomy (FAB) Ionizace (SIMS) Thermosprej (TSI) Ionsprej (IS) Elektrosprej (ESI) Plazmová Desorpce (PD) Laserová Desorpce (LD) Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI) Spojení separace a hmotnostní spektrometrie (on-line, off-line, čipy). Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 9 Stručná historie hmotnostní spektrometrie 1803 Daltonova atomová teorie "hmota se skádá z atomů; všechny atomy maji stejnou hmotu" ... ne tak docela: izotopy Důkaz izotopů: - spektroskopie: nepatrný posun čar ... vyžaduje kvalitní přístroj - MS: snadné stanovení Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 12 2 Stručná historie MS ve zbytku 20. stol. 1940 C. Berry: Elektronová ionizace (Electron Impact, EI) Struktura organických sloučenin 1950-70 MS používáno ke strukturní analýze organických sloučenin 1980+ Analýza těžkých a velmi těžkých molekul díky novým ionizačním metodám: FAB, PD, ESI a MALDI 2005 MS pro kvalitativní, strukturní i kvantitativní analýzu Široká škála komerčních hmotnostních spektrometrů MS nezbytná pro analýzu organických a biologických molekul Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 17 Základní koncepty hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometr přístroj, který z analyzované látky produkuje ionty a stanovuje jejich hmotnost, přesněji poměr hmotnosti a náboje Součásti spektrometru 1. Komora s iontovým zdrojem (zařízení na zavádění vzorku, iontová optika) 2. Hmotnostní analyzátor (iontová optika, magnet, detektor) 3. Vakuové pumpy (nízké, vysoké a ultra vysoké vakuum) 4. Řídící a vyhodnocovací elektronika, software Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 18 3 Hmotnostní spektrum Iontový signál vs. miz Iontový signál proud, často převeden na napětí, libovolné jednotky normalizace signálu: intenzita nejvyššího píku = 100% normalizace iontového signálu"] Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 19 Použité zkratky m hmotnost molekuly (u, a.m.u., Da) z počet náboj; (-) m/z účinná hmotnost (Th, Thomson), slang: hmotnost, hmota e elementární náboj (1.6x10-19C) U napětí (V) E intenzita elektrického pole (V/m, N/C) W energie, práce (eV, J) v rychlost iontu (m/s) r poloměr zakřivení (m) L dráha (m) l střední volná dráha molekuly t čas, doba (s) s srážkový průměr (m) sS srážkový průřez (m2) m redukovaná hmotnost (a.m.u., Da, kg) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 22 Hmotnostní spektrum Hmotnost, m a.m.u., u, Da (Dalton), počet atomových hmotnostních jednotek číselně rovný molární hmotnosti m/z - účinná hmotnost, Th (Thomson) Počet nábojů, z počet elementárních nábojů iontu obvykle ±1 výjimky, např. elektrosprej: |z| >> 1 Ionty: pozitivní a negativní, ne kationty a anionty. Hmotnostní spektrometrie, ne spektroskopie. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 20 Použité zkratky n číselná koncentrace (m-3) I proud (A), tok (m-2) T teplota (K) p tlak (Pa, Torr) R rozlišení (-) f frekvence (Hz) co úhlová frekvence (rad/s, s-1) a znak přímé úměry LD detekční limit, též LOD, limit of detection (obvykle mol, g, M) S/N poměr signálu k šumu (signal-to-noise ratio) RSD relativní směrodatná odchylka (relative standard deviation) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 23 Vybrané veličiny v hmotnostní spektrometrii Hmotnostní rozlišení Míra separace dvou přilehlých píků. Dvě definice: 1. FWHM (full width at half maximum), R = m/Am 2. Max. hmotnost, při které lze ještě rozlišit píky s jednotkovým rozdílem hmotností. Energie iontu • Joule, J • elektronvolt, eV atomy misto molů ... elektronVolty místo Joulů. 1 eV = 1.6 x 10-19 J jednoduchost: urychlovací napětí = 100 V, náboj = 1 ... E = 100 eV vhodné pro srovnání s energií ionizační, vazebnou, s energií fotonu atd. Tlak, p 1 atm = 760 Torr = 101 325 Pa = 1,01325 bar = 14,70 PSI Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 21 Izotopové paterny organických molekul Izotopy uhlíku: 99% 12C, 1% 13C Patern jako funkce počtu uhlíkových atomů v molekule: C: 99% 12C 1% 13C C2: 98% 12C12C 2% 12C13C 0.01% 13C13C C3: 97% 12C12C12C 3% 12C12C13C 0.04% 12C13C13C 10-4 % 13C13C13C Binomická řada Relativní výskyt lehkého izotopu, a Relativní výskyt těžkého izotopu, b Počet atomů, n Např. pro n = 2: (a+b)2 = a2 + 2ab + b2 Monoizotopická molekula obsahuje dané atomy ve formě jediného izotopu (u org. molekul obvykle atomy C - pouze izotopy 12C) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 24 4 Izotopové paterny organických molekul Relativní výskyt molekul v %: C6„ 100 U59 C 66 c2 21 c3 4.6 U100 100 p 1 U99 c 110 P 1 U98 c2 60 P 1 U97 c3 22 (normalizováno na výskyt monoizotopické molekuly /pouze 12C/ = 100 %) Se stoupajícím n přestává být monoizotopická forma dominantní a intenzity různých forem jsou porovnatelné (široká obálka) ... viz příklad dále. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Molecular formula: C60H90N12O12S2 Resolution: 20000 at 50% %lnt. 1234.6 100] 20 0 1236 1238 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Praktický dopad výskytu izotopů - Snížení citlivosti - Nutnost vysokého R při vysoké miz pro správné stanovení miz + Použití izotopových vnitřních standardů Přiklad: 5 peptidů/proteinů s poměrem zastoupení prvků C:H:N:O:S = 30:45:6:6:S R = 20 000 ^30H45N6O6S CgQHggN^O^Sj C90H135N18O18S3 C180H270N36O36S6... navíc ukázán pro různá R ^ľo^osr^C^Sg C360H540N272 0272S12 ^900^135oN180018gS3g C18ggH27ggN3gg03ggSgg Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Molecular formula: C90H135N18O18S3 Resolution: 20000 at 50% %lnt. 1852.9 10°] 1851.9 20 0 1_L 1854 1856 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Molecular formula: C30H45N6O6S Resolution: 20000 at 50% %lnt 617.3 100 80 60 40 61 3.3 20 619.3 0 I 6203 621 3 622.3 623.3 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 27 Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 20000 at 50% %lnt. 3705.9 100] 40 3703. 20 0 3704 3706 3708 3710 3712 3714 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Molecular formula: C1800H2700N360O360S60 Resolution: 20000 at 50% %lnt 37066.0 100 80 1 \ 60 / \ / i1 40 / Am/z ~ 12 \ 20 / \ / 0 ___ 37050 37060 37070 37080 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 34 Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 500 at 50% %lnt 3706.6 100 80 / \ 60 I \ 40 / Am/z ~ 9 \ 20 / \ 0 3695 3700 3705 3710 3715 Mass/Charge 3720 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 35 Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 2500 at 50% %lnt. 3706.2 100 A 80 / \ 60 / \ 40 / Am/z ~ 4.5 \ 20 / \ 0 3695 3700 3705 3710 3715 3720 Mass/Charge Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 36 6 Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 5000 at 50% %lnt 3705.9 100 íl 80 3704.8 3707.9 60 M Íl 40 II3708.9 3703J8 A 20 í 3709.9 / 37II.0 0 j \-sJ371_4.0 3718.0 3695 3700 3705 3710 3715 Mass/Charge 3720 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 37 II. Ionizační techniky a zavádění vzorku vzorek (atm. tlak) — vzorek (vakuum) Nežádoucí jevy • nárust tlaku v iontovém zdroji • ochlazování a mrznutí vzorku v důsledku vypařování • adsorpce látek ze vzduchu (např. vody) na stěny iontového zdroje Rozdělení vzorků podle skupenství • Tekuté vzorky plynné vzorky kapalné vzorky (kapalný analyt, rozpuštěný analyt) • Tuhé vzorky těkavé (lehké sloučeniny) netěkavé (polární, polymerní látky) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 41 Vícenásobně nabité ionty • Typický příklad: vícenásobně nabité ionty [M+zH]z+ z elektrospreje "Obálka" ve tvaru zvonu. • Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu). S m = 10 000 Da z 4 56789 10 m/z 2501 2001 1668 1429 1251 1112 1001 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 39 Zavádění vzorků Off-line On-line In-line k pumpě Počet zaváděných vzorků • 1 vzorek • Více vzorků • sériově (diskrétní vzorky nebo spojitý tok) • paralelně Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 42 7 Mechanismus El Interakce elektronu s molekulou analytu ABC: e- (rychlý) + ABC — ABC+ + 2 e- (pomalé) Výsledná rovnice, ABC - ABC+ + e- je charakterizována ionizační energií ABC, AH(ABC). Ionty ABC+ s přebytkem energie se mohou dále rozpadnout: (ABC+)* — AB+ + C, A + CB+ atd. Stupeň fragmentace závisí na energii elektronů, E(e-) a na struktuře analytu: a) £(e-) ~ ionizační potenciál =i> tvorba molekulárních iontů. Ionizační potenciál jednoduchých organických molekul ~10 - 12 eV. b) E(e) >> ionizační potenciál =i> fragmentace. Typ fragmentace záleží na struktuře analytu; sloučeniny s podobnou strukturou mají podobná fragmentační spektra. Interpretace spekter. Knihovny spekter (> 100 000 spekter). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Chemická ionizace (CI) 20. léta 20. století A. J. Dempster Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn Reaktivní plyn (RH) CH4, butan, H2, NH3 atd. p(ABC) < 104 Pa p(R) ~ 0.1 Pa (l ~ 0.05 mm, mnoho kolizí ve zdroji) Mechanismus tvorby iontů a) produkce RH+ e- (rychlý) + RH — RH+ + 2 e- (pomalý) b) přenos náboje RH+ + ABC — RH + ABC+ Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 44 47 Mechanismus El Prahová energie, AE (appearance energy) při níž se objeví dané fragmenty, nemusí být větší než AH(ABC)! ABC — ABC+ + e- Ionizační energie ABC, AH(ABC) ABC — AB+ + C + e- Prahová energie AB+, AE(AB+) AE(AB+) = AH(ABC) + D(ABC+) Dissociační energie ABC+, D(ABC+) Absorpce elektronů při průchodu plynem ionizované látky Úbytek proudu elektronů, dl při průchodu infinitesimálně tenkou vrstvičkou analytu: dl = -acldx, po integraci: l = l0 e-ax. l proud elektronů (A) c koncentrace molekul ABC, (cm-3) (c = p/RT) x tloušťka vrstvy (cm) a průřez (cm2) ... analogie koeficientu s v Lambert-Beerově zákonu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 45 Mechanismus tvorby iontů při CI (pokr.) c) přenos protonu (běžnější) RH+ — R + H+ PA(R) protonová afinita ABC + H+ — ABCH+_- PA (ABC) RH+ + ABC — R + ABCH+ AE = PA(R) - PA(ABC) AE < 0: exotermní, preferovaná reakce AE << 0: přebytek energie ABC+ =i> fragmentace ABC+, strukturní analýza AE < 0, AE — 0: ABC+ a ABCH+ převládají: + kvantitativní analýza + molekulová hmotnost ABC + vysoká ionizační účinnost (ABC) - žádná informace o struktuře Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 48 8 Kolize molekul při Cl Střední volná dráha molekuly Střední dráha, kterou urazí iont mezi 2 srážkami 1 = (^2no2n )-1 l(cm) = 0.66\p(Pa) (pouze hrubý odhad) Počet kolizí m redukovaná hmotnost, m = (mv1 + m2"1)-1 o kolizní průměr 02 průřez molekuly CI: 1015-16 kolizí, vysoká ionizační účinnost (ABC) Porovnání Cl vs El + silnější signál - vyšši šum + celkově vyšší poměr S/N (LOD organických látek ~ pg) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 49 Zavedení vzorku pro El/Cl (pokr.) ii) membránové interface - zavedení analytu přes membránu, oddělení nosného plynu pomocí membrány c) přímý vstup z kapilární GC kolony (nižší tok nosného plynu, He) 2. Těkavý, termálně stabilní pevný vzorek Přímé vložení vzorku na sondě (sklo, keramika, ocel). Po vložení vzorku do spektrometru dochází k jeho odpařování a ionizaci v plynné fázi. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 52 Negativní chemická ionizace Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn Mechanismus 1. Produkce termálních (pomalých) elektronů e- (rychlý) + RH — RH+ + 2 e- (pomalý) l/V(pomalý e) ~ 3/2 kT T ~ 400 K => E ~ 0.1 eV 2. Záchyt elektronu ABC + e- — ABC- Přednostně u sloučenin s elektronegativními skupinami (PCB, NO3- atd.) LD ~ pg Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 50 Zavedení vzorku pro El/Cl (pokr.) 3. Netěkavé látky - Velké molekuly - Molekuly s mnoha polárními skupinami ... mnoho zajímavých sloučenin (proteiny, DNA, sacharidy) a) Příprava těkavých derivátů a následná standardni ionizace (EI, CI). Vhodné pro molekuly s M < 1000 Da. Příklad: esterifikace, RCOOH + CH3OH — RCOOCH3 b) Použití klasické ionizace v desorpčním provedení. Vzorek nanesený na sondě je vsunut do iontového zdroje, kde dochází k přímé interakci elektronů se vzorkem v kondenzované formě. c) Jiné ionizační techniky "Měkká" ionizace: produkce molekulárních iontů aniž by došlo k jejich tepelnému rozkladu: FAB, Elektrosprej, Laserové desorpční metody Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 53 Zavedení vzorku pro EI/CI 1.Plyn/těkavá kapalina • Analýza zbytkových plynů ("residual gas analysis"): otevřený iontový zdroj v komoře s plynem: p(komora) = p(plyn) • Eluent ze separační kolony (GC-MS) Problém: Vysoký proud plynu z klasických kolon GC a) oddělení a sběr frakcí (split, splitter) b) rozhraní (interface) pracující bez přerušení i) tryskový separator (particle beam) kolona-* / \ _ pro obohacení ABC -1 1— v nosném plynu IJI vyžaduje M(ABC) >> M(nosič) vakuová ... He jako nosný plyn pumpa Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Anorganické iontové zdroje Doutnavý výboj Termální ionizace Indukčně vázané plasma Další techniky vhodné pro analýzu anorganických vzorků, např. laserová desorpce, jsou použitelné i pro organické látky a biomolekuly a budou zmíněny později Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 MS 51 54 9 Doutnavý výboj První iontový zdroj (J. J. Thompson) Analýza pevných vzorků, obvykle vodivých. Přesná a celkem citlivá analýza: RSD LOD ~1 ppb. Výboj v Ar (p ~100 Pa): Ar+ vyrážejí atomy kovu M z destičky vzorku a později je ionizují na M+. Ar 100 Pa do MS, 0.1 Pa katoda, destička I vzorku (+) anoda (-) vstup do hmotnostního analyzátoru Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 lnduktivně vázané plazma (lnductively Coupled Plasma, lCP) KS °°°° kPa 11100 Pa | | 0.1 Pa aerosol _ vzorku Ar, 1L/min radiální tok Ar, 10 L/min ionty atomy série otvoru (differenciální pumpování) 1. Desolvatace MX (aq, aerosol) 2. Vypaření MX (s) 3. Atomizace MX (g): disociace na M(g) a X (g) 4. Ionizace na M+ (g) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 55 58 Termální ionizace (TI) žhavené | 0.1 vlákno--|-j Pa _ i — k MS )— \> Vzorek nanesen na vlákně; vlákno odporově zahříváno. Vypařování, atomizace a ionizace: MX (s) — MX (g) — M (g) + X (g) M (g) — M* (g) + e- (vlákno) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 56 vlákno M(g) Termální ionizace Saha-Langmuirova rovnice n(M+)/n(M) x exp[(W - lE)/(kT)] Pracovní funkce kovu (vlákno), W ~ 4 eV M+(g) Kov IE (eV) (W - IE) (eV) K Ca Fe Zn 6.0 7.8 9.4 -0.5 -1.5 -S.9 -5.4 účinné slabé • Tři vlákna (s rozdílnou teplotou): Náhrada jednoho vlákna, které odpařuje a ionizuje vzorek příliš rychle. Stabilnější iontový tok (RSD pouze ~ 0.1 % !) Užitečné pro stanovení izotopového zastoupení. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Diferenciální pumpování 101 kPa I 1k Pa I 100 Pa I 1 Pa iontový zdroj I l pumpa 1 pumpa 2 pumpa S - často používaný koncept v MS - použit u technik ionizace při atmosferickém tlaku Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 e- MS 4.6 57 60 10 ICP Supersonická tryska Žhavá plazma (5000 K) proudí dovnitř otvorem a expanduje nadzvukovou rychlostí. Náhodný pohyb atomů na atmosferické straně je charakterizován širokou distribucí kinetické energie (5000 K) a relativně nízkou střední translační rychlostí. Uvnitř se atomy pohybují nadzvukovými rychlostmi s velmi úzkou energetickou distribucí ... supersonické ochlazení (~300 K). Distribuce je později narušena srážkami s okolním plynem (barrel shock, Machův disk). Účinná ionizace 90 - 100 % většiny prvků ionizováno (velmi uniformní ionizace). Vhodné pro stanovení izotopového zastoupení (nízká systematická odchylka). Nevýhody • nevhodné pro určování struktury molekul • interference Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 61 Spektrální interference v ICP Příklady izobarických iontů a rozlišení potřebného k jejich stanovení. Izotop Rušící iont Rozlišení 39K 38Ar1H+ 5690 40Ca 40Ar+ 71700 41K 40Ar1H+ 4890 44Ca 14N14N16O+ 970 12C16O16O+ 1280 52Cr 40Ar12C+ 2380 56Fe 40Ar16O+ 2500 75As 40Ar35Cl+ 7770 80Se 40Ar40Ar+ 9690 Pozn.: vyšší rozlišení často znamená nižší citlivost. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 64 ICP Ionizace polem (Field Ionization, FI) Detekční limity Vysoké elektrické pole mezi ostrými hroty, E > 109 V/m 1 ppt (kvadrupól) Odstranění elektronu vnitřním tunelovým jevem. 10 ppq (magnetický sektor) pro srovnání: ICP-AES a AAS: ppm - ppb ppm ppb ppt ppq million 106 billion 109 trillion 1012 quadrillion 1015 Interference 1. Nespektrální Posun ionizačních rovnováh v důsledku přítomnosti matrice, kyselin, snadno ionizovatelných prvků atd. 2. Spektrální Ionty izotopů Izobarické molekulární ionty Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 62 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 65 Spektrální interference v ICP Tvorba molekulárních iontů v ICP 1. Plyn plazmatu a jeho reakční produkty (Ar+, Ar2+, ArH+, ArO+, ArC+, ArN+ atd.) 2. Vzorek nebo solvent (hydridové ionty, OH+, ClO+, NO+, CaO+, LaO+ atd.) 3. Chemická ionizace plynů pozadí (H2O+, H3O+, CxHy+ atd.) Odstranění spektrálního rušení 1. Matematické korekce (např. ze známé distribuce izotopů) 2. Desolvatace aerosolu (např. vymrazení v kapalném N2) 3. Studené plazma (relativní změny ionizačního stupně) 4. Kolizní cela (termalizace iontů, posun reakčních rovnováh) 5. Spektrometr s vysokým rozlišením Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 6S Desorpční ionizační techniky LDI Laser Desorption/Ionization 1963 R. Honig FD Field Desorption 1969 H. D. Beckey PD Plasma Desorption 1974 R. D. MacFarlane FAB Fast Atom Bombradment 1981 M. Barber SIMS Secondary Ion Mass Spectrometry 1976 A. Benninghoven MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization 1988 M. Karas & F. Hillenkamp, K. Tanaka Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 66 11 MS sekundárních iontů (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) Ionizace ionty paprsek primárních iontů, ~ 6 keV k MS analyzátoru J sonda s pevným vzorkem, +3 kV • Primární iontový svazek může být skenován, výsledkem je topografie prvků vzorku, "Ms image". Rozlišení vyšší než u optického skenování (svazek primárních iontů lze lépe zaostřit, ~nm). • Produkty . především atomy a neutrální molekuly, též ionty. Případná postionizace možná, např. fotoionizace pomocí laseru. • Anorganická i organická analýza, v poslední době i lehčí biopolymery za účasti matrice, "matrix-assisted SIMS". Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 69 Standard FAB Continuous-flow FAB 1360 1380 1400 Zdroj: R. Capriolli m/z Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 TD O E 6 E ■co E o > udi tp e p m u rtk e p s I4Z0 HK 72 12 CF-FAB MS/MS řetězce a lidského hemobloginu r*X 5 0 i->X 1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z HK Zdroj: R. Capriolli Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 73 Pl Příklad uspořádání: LD-Pl PI jako postionizace pro laserovou desorpci 1. Puls desorpčního laseru 2. Desorpce obláčku (přev. neutralů) 3. Puls ionizačního laseru 4. Extrakce iontů + ! - + i _ Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 76 Fotoionizace (Photoionization, Pl) M + n hv — M+ + e- Nutná podmínka: nhn> lE(M) Typy fotoionizace 1. Jednofotonová ionizace (single photon ionization, SPI) n = 1 2. Multifotonová ionizace (multiple photon ionization, MPI) n > 1 • neselektivní analýza vhodná pro anorganické analyty 3. Rezonanční multifotonová ionizace (REMPI) n > 1 • pokud hn= W (energie elektronového přechodu M) • velmi selektivní a velmi citlivé stanovení • aromatické molekuly, barviva, léky Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 74 Plazmová desorpce (PD) 1974 Ronald D. Macfarlane (R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974, 60, 616.; R. D. Macfarlane, D. F. Torgerson Science 1976, 191, 920.) • První technika použitá k ionizaci relativně velkých organických molekul (~tisíce Da , př. inzulín, 5735 Da). • Štěp z radioaktivního zdroje narazí do vzorku naneseného na fólii. • Jiný štěp uvolněný z rozpadu téhož atomu 252Cf nastartuje záznam signálu. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 77 Mechanismy fotoionizace e e e /E(M) hv SP MPI REMPI Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 75 Experimentální uspořádání PD ■^9 Ha. Ragmen] ion s Zdroj: R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, "New approach to the mass spectrometry of nonvolatile compounds", Biochem. Biophys. Res. Commun. 60, 616-621, (1974). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 78 13 PD: příklad (M+2Hf Mass (m/z) Pozitivní PD MS ribonukleázy A z hovězí slinivky (D. M. Bunk, R. D. Macfarlane Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 6215-6219) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 LDI, MALDI Laserová desorpce/ionizace (Laser Desorption/Ionization, LDI) S objevem laseru v 60. letech 20. století Zpočátku anorganické (R. Honig, Appl. Phys. Lett. 1963, 2, 138-139), později organické látky (M. A. Posthumus, P. G. Kistemaker, H. L. C. Meuzelaar, M. C. ten Neuver de Brauw, Anal. Chem 1978, 50, 985). Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) Vhodná pro těžší analyty, polymery, biomolekuly. Karas, M; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53 - 68. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 79 82 The Nobel Prize in Chemistry 2002 MALDI ESI Zdroj: www.nobel.se October 9, 2002 Hmotnostní spektromt b. 83 14 Schema MALDI (detail) oj o { o ° ° ° ° o aoo Plynná fáze o Puls laseru oo o0 OOqOOO Analyt o mm O JVv O OO O °°0 O OnOoQntin vzorku oooo o dobo o u u o u o Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Požadavky na matrici (MALDI) 1. Absorbce při vlnové délce použitého laseru (UV, IR). 2. Tvorba žádoucích krystalů s analytem (empirie). 3. Obvykle kyselina (účinný přenos protonu na analyt). 4. Stabilní, nereagující s analytem, nepříliš těkavá. Typy matricí • aromatické kyseliny (Karas & Hillenkamp) • glycerol s přídavkem jemného kobaltového prášku (Tanaka) • modifikovaný povrch, např. Si - DIOS (Siuzdak), SELDI Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S5 SS Běžné matrice pro MALDI sinapinic acid (SA) gentisic acid (DHB) (3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) (2,5^^— ~id) a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) \. "IPA) pyridinecai ^jj^ 3- (3- Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 SQ Princip LDI a MALDI 1. Velmi krátký puls laseru, typicky t ~ ns (LDI, MALDI), max. jms. Molekuly se odpaří dříve, než se rozloží. Ochlazení expanzí: konverze Evib na Etrans (collisional cooling). 2. Energie je absorbována převážně matricí (M), ne analytem. e (matrice) >> e (analytu), c(matrice) >> c(analytu) Matrice MH+, M+, M*, fragmenty, ionty fragmentů. Analyt, rozptýlený v matrici, se odpařuje spolu s matricí. 3. Matrice se podílí na ionizaci analytu ABC. Matrice je excitována po absorbci jednoho či více fotonů. Dominantní ionizační mechanismus = přenos protonu: MH+ + ABC - M + ABCH+. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 ST Běžné matrice pro MALDI ferulic acid dithranol (DIT) (4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid) O OH O OH O CH3 2,,4,.6,-trihvdroxvacetophenone (THAP) 2,-6'-dihydroxyacetophenone o Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Q0 15 Běžné matrice pro MALDI nicotinic acid-N-oxide 2,-(4-hydroxy-phenlyazo)-benzoic acid (HAB AI trans-3-indoleacrylic acid (IAA) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Vn=n-(/ voh picolinic acid (PA) (2-pyridine carboxylic acid) Lasery UV-MALDI 337 nm dusíkový laser (nejlevnější a nejběžnější) 355 nm Nd :YAG (3xf) 266 nm Nd:YAG (4xf) 193 nm ArF ... fragmentace! Pozn.: YAG lasery jsou dražší, ale mají delší životnost a dosahují vyšších frekvencí (kHz vs. Hz). IR MALDI 2.94 mm Er:YAG laser 10.6 mm CO2 laser Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 91 94 Matrice - aplikace peptidy < 10 000 CHCA, DHB peptidy, proteiny > 10 000 SA, DHB oligonukleotidy < 3 kDa THAP nukleové kyseliny > 3 kDa HPA syntetické polární polymery DHB syntetické polární polymery DIT, IAA karbohydráty DHB, CHCA, THAP Přídavky komatricí (např. monosacharidů) - zlepšení krystalizace, homogenity vzorku, rozlišení, potlačení fragmentace Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 92 Vlastnosti matrice CHCA: „horká" matrice peptidy < 10 000 Da vhodná pro PSD (strukturní analýza) DHB: „studená" matrice univerzální použití Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 93 16 Akumulace spekter zpravidla zaznamenáváme průměr z 10 - 100 desorpcí zvýšení odstupu signálu od šumu a reprodukovatelnosti signál, S o n šum, N oc Vn signál/šum, SIN x Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 97 Charakteristika MALDI + jedna ze dvou nejpoužívanějších metod pro biopolymery (vedle ESI) + měkká ionizace + jednoduchá spektra, většinou z = +1 nebo z = -1 + pulsní ionizace (předurčena ke spojení s TOFMS) + limit detekce ~ amol (peptidy, při vhodné přípravě) + rychlá příprava a analýza vzorků Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Zásady při přípravě MALDI vzorků Rekrystalizace matrice Čerstvý roztok matrice Vhodná volba solventu (ACN, EtOH, MetOH, aceton, voda) pH matrice < 4 (úprava např. 0.1 % TFA) Analyt musí být rozpuštěný Purifikace analytu před MALDI analýzou Neznámý analyt - příprava série roztoků o různých koncentracích Nanesené vzorky jsou obvykle stabilní (skladování terčíků se vzorky) Dokonalé očištění terčíku Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 99 102 17 Metody přípravy vzorků vysušení kapky směsného roztoku (dry droplet) smíchání a vysušení na terčíku (quick & dirty) urychlení vysoušení ve vakuu (vacuum drying) nejprve vrstva matrice v těkavém solventu (fast evaporation) vrstva matrice, pak vrstva matrice s analytem (overlayer) vrstvy: matrice, analyt, matrice (sandwich) krystaly rozdrceny, převrstveny roztokem vzorku (crushed crystals) rozpuštění vzorku v kapce acetonu (acetone redeposition) nanášení na rotující terčík (spin coating) pomalý růst krystalů (slow crystallization) nanášení elektrosprejem (electrospray deposition) modifikované terčíky - hydrofilní/hydrofobní rozhraní Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 103 Perspektiva MALDI MS analýza početných sérií biologických vzorků • peptidové mapování pro identifikací proteinů (MALDI MS produktů enzymatického štěpení proteinů) • peptidy, proteiny, oligonukleotidy, sacharidy Mikrometody Spojení se separačními technikami • výhoda archivování vzorků na MALDI terčíku • uvedení dostupných MS/MS spektrometrů pro MALDI • doplňková technika k ESI (odlišná ionizační účinnost pro různé analyty) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 107 On-line ionizační techniky Ionizace za atmosferického tlaku (Atmosferic Pressure Ionization, API, též sprejové ionizační metody) Společné znaky • Analyt: polární, často ionizovaný v roztoku. • Vyhřívané kapiláry a jiné elementy iontového zdroje (stovky °C) • Přídavné elementy pro zvýšení ionizační účinnosti (svazek elektronů, el. oblouk) • Diferenciální pumpování • Často po předcházející separaci ... 2D separace (MS jako druhý rozměr). • Fáze ionizačního procesu: 1) tvorba kapek aerosolu 2) odpařování rozpouštědla 3) analýza iontů Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 112 Mikrometody - příklad (A) úprava vzorku a dávkování (B) reaktor s imobilizovaným enzymem (C) mikropipetor (d) nanovialky (300 x 300 x 20 mm) na MALDI terčíku (E) automatizovaná MALDI-TOF MS Ekstrom, S., Onnerfjord, P., Nilsson, J., Bengtsson, M., Laurell, T., Marko-Varga, G. Anal. Chem. 2000, 72, 286-93 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Termosprej (TSI) eluent z LC nebo CE kolony vyhřívaná kovová kapilára (~ 200 °C) sprej kapek k mechanické pumpě (100 Pa) k MS (-) Roztok vř+e ve špičce kapiláry, tvoří se kapky, později suchý aerosol a ionty MH+. Spektra podobná jako u CI, převládají molekulární ionty. Do zdroje mohou být vloženy elektrody - přídavný výkon - vyšší účinnost ionizace. Elektronegativní sloučeniny mohou tvořit negativní ionty. (Do komory může by- t vložen přídavný zdroj elektronů, aby zvýšil tvorbu negativních iontů M -.) Použití těkavých pufrů - prevence zacpávání špičky kapiláry (NH4AC). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 110 113 Srovnání LDI a MALDI LDI MALDI Ionizace relativně tvrdá měkká Vzorek pouze analyt analyt v přebytku matrice Max. m (Da) <10 000 106 Typický analyt malé organické molekuly, malé peptidy, syntetické polymery peptidy, proteiny, DNA, sacharidy, syntetické polymery Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 111 Ionizace svazkem částic (Particle Beam Ionization, PBI) maěs filter Typická sestava PBI pro GC a LC. (zdroj: www.micromass.co.uk ) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 114 19 Ionizace svazkem částic (Particle Beam lonization, PBI) Princip • Odvozen od "generátoru monodisperzního generátoru" aerosolu: R. C. Willoughby, R. F. Browner, "", Anal. Chem., 56, 2626-2631, (1984) • Velmi podobné TSI a vyhřívanému zmlžovači. Přídavný zdroj svazku částic, obvykle He. Separátor He od iontů. • Přídavný El zdroj může být použit = výsledkem jsou El spektra (s vyšším šumem v důsledku přítomnosti iontů a molekul rozpouštědla). Charakteristika • Spektra podobná jako v případě TSI. Více fragmentů. • Méně citlivý než TSI a ESI. • Vhodný pro tepelně stálé, neiontové sloučeniny s nepříliš vysokou hmotností. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 115 Elektrosprej (ESI)*, Nanosprej+ *Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451. *Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4671. + Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167. Schema infuze, ml_C, CE jehla (křemen, pokovený křemen, kov) přídavná kapalina (sheath liquid) -není nutná Protielektroda s otvorem, fnozzle" (0 V) I vyhřívaná 1_5kV / kapilára přídavný plyn atmosferický tlak - není nutný 100 Pa k MS Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Vyhřívaný nebulizer vyhřívaný element r~ plyn -LC, CE ■ plyn ■ výboj lonty extrahovány skrz sérii otvoru do MS analyzátoru atmosferický tlak • Spektra podobná Cl, obvykle záchyt 1 protonu ([M+H]+). • Nízké procento fragmentace (měkká ionizace). • Vhodné pro střední hmotnosti (-2000 Da). • Struktura? ... Nutno použít přídavnou kolizní celu (MS/MS). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Princip ESI Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Iontový sprej (Ion Spray, IS) plyn -► LC, CE -► " plyn -► vyhřívaný element | ^ i- ■ ■ atmosferický tlak S D lonty r-i \ extrahovány H t i s^rz s®r''otvoru U U do MS (+) (") 1 N2 (vysoušení vzorku) • Pouze pozitivní ionty proniknou přes elektrody, negativní jsou odstraněny. • Vícenásobně nabité ionty [M+H]\ [M+2H]2*, [M+3H]3*, [M+4H]4* atd. • Plněné LC kolony se splitterem, mikrokolony, kapilární kolony. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 117 Taylor core Needle tip Princip ESI • Tvorba Taylorova kužele vlivem elektrického pole. Koncentrace kladného náboje v kuželi, destabilizace menisku a emise kapek s nadbytkem kladného náboje. • Snižování objemu a zvyšování hustoty povrchového náboje kapek díky vypařování rozpouštědla. • Nesymetrické štěpení nabitých kapek (Rayleighův limit stability); výchozí kapka ztrácí ~15% náboje ale jen 2% objemu. • Velikost kapek: mm nm. Počet nábojů v kapce: 105 10. (Velikost makromolekuly ~ nanometry.) • Vznik iontů v plynné fázi. • Sekundární reakce v plynné fázi. • Transfer iontů do komory MS. • Nedochází k výboji; výboj je nežádoucí. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 121 Vlastnosti ESI • Velmi "měkká" ionizace vhodná pro biomolekuly. • Velmi vysoký limit max. hmotnosti, m ~ 106 (miz mnohem menší). Ionizace těžkých polymerů (i celého viru). • Tvorba vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+ "Obálka" ve tvaru zvonu. Typické pro iontový sprej či elektrosprej. Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu). S m/z Př.: m = 10 000 Da z 4 56789 10 m/z 2501 2001 1668 1429 1251 1112 1001 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 124 Provedení ESI • Přídavný plyn - proud N2, vyhřívaná kapilára za otvorem: dokonalejší desolvatace, zabránění tvorby klastrů. • Koaxiální proud kapaliny možný (... přídavná koaxiální kapilára). • Rozměry jehly: i.d. < 100 mm, o. d. 100 mm - 1 mm, hrot < 100 mm. • Vzdálenost hrotu od protielektrody: 1 - 3 cm. Tok < 10 mLimin. • Nanosprej: menší rozměry, bez přídavné koaxiální kapaliny a nuceného pumpování, tok < 100 nL/min. • Uspořádání trysky a otvoru (... oddělení iontů od balastu): Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 122 Tvorba vícenásobně nabitých iontů + Vyšší z snižuje miz =i> lze použít hmotnostní analyzátor s nižším limitem max. hmotnosti i pro ionty o velmi vysoké hmotnosti. + Ke zjištění m a z stačí pouze 2 sousední píky: (miz)n = (m+n)in (miz)n+1 = (m+n+1)i(n+1) + Ovlivnění náboje z ? • pH roztoku: pHi =i> zt pHt =i> zi, negativní náboj převládá • p- zářič, jiný zdroj e- (záchyt e- analytem =i> z i) - Spektrum směsi složitější (ale může být vyhodnoceno). Jedna látka je přítomna v několika formách a dává několik píků ve spektru ... komplexní spektra, snížená citlivost. - Často další píky, např. adukty [M+Na]+, [M+K]+ atd. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 125 Provedení ESI • Uspořádání trysky a otvoru ... oddělení iontů od balastu - v ose (on-axis) - mimo osu (off-axis) - diagonální (tilted) a kolmé (orthogonal) - Z-sprej • Připojení el. napětí - přes přídavnou kapalinu (sheath flow) - kapalinový spoj (liquid junction) - pokovený hrot kapiláry (sheathless inteface) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 123 ESI • Aplikace elektrického pole (nozzle-skimmer) =i> fragmentace ve zdroji. • K objasnění struktury - přídavná komora pro kolizní disociaci za prvním MS. • Příbuznost ESI s dalšími API: - APCI = Atmospheric Pressure Chemical lonization (solvent působí jako reakční plyn ... ionizace podobná CI) - jehla je vyhřívána - nulové napětí na jehle - přídavné elementy: -elektroda pro výboj před vstupním odporem -piezoelektrický element ke zlepšení zmlžení -zmlžovač (Iontový sprej někdy označován jako pneumatický ESI) • Signál v ESI je závislý na koncentraci analytu, c(analyt); při velmi nízkých koncentracích je závislý na látkovém množství analytu (nanosprej). • Signál a c(analyt) (10-7 - 10-3 M), při vyšších c se růst zpomaluje (plato). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 126 21 Faktory ovlivňující ESI • Typ analytu • Jehla, sprejovací špička (rozměry, uspořádání) • Napětí mezi jehlou a protielektrodou • Spotřeba roztoku (solventy, additiva, soli, iontově párovací reagenty) • Průtok vzorku, přídavné kapaliny a sušícího plynu • Teplota ústí kapiláry Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 127 III. Hmotnostní analyzátory • Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů. • Energetický analyzátor • Hmotnostní analyzátory • Detekce iontů • Základy vakuové techniky • Spojení separace - MS. Čipy • Nové techniky/technologie Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 130 Zásady v ESl • Použití těkavých pufrů: - CH3COOH - HCOOH - TFA (kyselina trifluoroctová) - NH4+ soli těkavých kyselin • Koncentrace solí < 20 mM • Vystříhat se použití síranů, fosfátů • Pravoúhlý nebo Z sprej mohou částčně pomoci v případech, kde se nelze řídit výše uvedenými zásadami. • Pro pozitivní ionizaci pKa (elektrolyt) < pK (analyt) - 2 • Pro negativní ionizaci pK (elektrolyt) < pK (analyt) - 2 • Důkladná příprava vzorku = snazší analýza odsolení, odstranění surfaktantů a dalších příměsí Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 128 Základy iontové optiky Analogie se světelnou optikou štěrbina štěrbina čočka čočka hranol, mřížka energetický analyzátor, deflektor m/z: hmotnostní analyzátor zrcadlo iontové zrcadlo optické vlákno iontový vodič Odlišnosti od světelné optiky vlnová délka, l kinetická energie, Wkiri hmotnost/náboj, m/z index lomu neměnný možné ladění elektr. nebo magn. pole časově proměnná pole během experimentu nezávislé na intenzitě vzájemné odpuzování iontů Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 131 22 Čočka (elektrostatická, Einzelova čočka) V + V • analogie klasické čočky • ohnisková vzdálenost může být změněna změnou napětí 1 • vyšší iontová propustnost ve srovnání se štěrbinou • fokální vzdálenost není funkcí m/z (pro ionty ze stejného iontového zdroje) • ideální funkce pouze pro ionty o stejné kinetické energii - pokud je vzájemné odpuzování iontů zanedbáno (space-charge effect) • zobrazená čočka je jen jednou z mnoha možných sestav Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 1S4 Vlastnosti iontů Vlastnosti iontu m/z hmotnost/náboj v rychlost (kinetická energie, W = mv2/2) t čas x, y, z souřadnice a úhel (směr) to čas zrodu (indexo . zrod iontu) Vlastnosti skupin iontů (nejčastěji o totožném m/z) . popsány disperzemi, distribucemi v (W), x, y, z, to, a Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 1S7 Vlastnosti iontů Př.: Distribuce počáteční rychlosti při MALDI (Pv . pravděpodbnost výskytu molekuly o rychlosti v) Pv protein 0 1000 2000 vo (m/s) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 1SS 23 Weinův rychlostní filtr + v/2 v + + B L -V/2 • Příčné elektrické pole mezi dvěma plochými elektrodami • Příčné magnetické pole • Vektor intenzity elektrického pole E je kolmý na vektor magnetické indukce B • Na iont půspbí opačně orientované el. a magn. síly Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 139 Energetický analyzátor Zrychlení: Energie: mv2 _ r mv2 ~2~~ zeE , kde E-V L Poloměr zakřivení: 2U ' E Poloměr zakřivení je přímo úměrný kinetické energii iontu. Ve vztahu nehraje roli m/z. I tlustější rovnoběžné svazky iontů jsou zaostřeny. ■ Zaostření může být optimalizováno v obou dimenzích, použije-li se plechů zakřivených v obou rozměrech (i axiálně). Sektor - tvar výřezu z kruhu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 zeU 142 Hmotnostní analyzátory Magnetický sektor (MAG, B) Quadrupólový analyzátor (Q, q) Iontový cyklotron (ICR-FT-MS) Iontová past (IT) Průletový, Time-of-flight (TOFMS) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 143 Energetický analyzátor; elektrostatický analyzátor (ESA, E) + V ESA vstupní štěrbina -- "Or—"--^N/ \^ y^^l^^yr \/výstupní štěrbina iontový -v// \ zdroj <(^(+f\^ +U Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 141 24 Princip magnetického sektoru 1.) Lorentzova síla = odstředivá síla: mv2 Bzev=- r m eBr z v 2.) Kinetická energie = urychlovací energie: mv2 m^ = zeU 2 m eB2r2 7 ~ 2U Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 145 Tandem EB • Disperze vlastností iontů (v, x, a) a nestabilita polí (6, U) ovlivňují kvalitu spekter. • Zařazení ESA před MAG řeší problém disperze rychlosti v (kinetické energie Wkm) iontů vstupujícich do magnetického sektoru. Praktické geometrie EB: 1. Nier-Johnsonova 90o ESA + 60o MAG výstup stále zaostřen pro daný poloměr, r vhodná pro skenovací spektrometry 2. Mattauch-Herzogova 31.8o ESA + 90o MAG jedna fokální rovina pro ionty o různých hmotnostech vhodná pro plošný detektor (fotodeska, pole) 3. Matsudova vhodná pro kompaktní přístroje Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 14S Princip magnetického sektoru m = eB2r2 7 ~ 2U Způsoby skenování spektra: • Posunem výstupní štěrbiny, r. Konst. U, 6. • Změnou U, konst. 6. Problémy s nízkou extrakční účinností při nízkých hodnotách U. • Změnou B, konst. U. Dříve obtížné, nyní převládající řešení. Peak switching Skoková změna některé z proměnných. Vhodné pro monitorování omezeného počtu druhů iontů (např. přepínáním U). Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 146 Mattauch-Herzogova geometrie Magnetic si um Ion lani EkcKotUtK fieU Magnat« f*(d Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 149 25 Další kombinace E a B Reversní geometrie (Reverse-geometry, BE) 1. magnetický sektor: hmotnostní filtr 2. energetický analyzátor: analýza iontů podle kinetické energie MIKES (Mass-Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry) první MS/MS technika, tandemová hmotnostní spektrometrie (1973) 1. Magnetický sektor propustí ionty o určité hmotnosti. 2. Metastabilní ionty se rozpadnou v oblasti mezi magnetickým a energetickým analyzátorem. 3. Dceřinné ionty vzniklé z rozpadu se rozdělí podle kinetické energie v energetickém analyzátoru. Celá řada hybridních přístrojů založených na E a B: EBE, BEB, EBEB, BEBE ... Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 1 Quadrupole field EMA i Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 154 Kvadrupólový hmotnostní filtr (Quadrupole MS, Q, q) -U-Vcos(ot) U+Vcos(wt) 4 tyče hyperbolického (též kruhového, čtvercového nebo jiného) průřezu U... DC složka napětí V... AC (RF) složka napětí w ... úhlová frekvence, w = 2pf, f = 1 - 3 MHz, fázový posun 180o Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 1 Kvadrupólový hmotnostní filtr Rovina xz: těžké ionty procházejí Rovina yz: lehké ionty procházejí ... pouze ionty o specifické m/z projdou kvadrupólovým filtrem, ostatní ionty jsou odchýleny. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Trajektorie iontů v kvadrupólovém filtru Low-mass shoulder Selected ions for transmission high-mass shoulder Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 xz yz yz 153 156 26 Vlastnosti kvadrupólového filtru Zvýšení rozlišení. (Rozlišení, R < 10 000, obvykle R < 2 000.) • Pro urychlovací napětí, Uacc (směrem do kvadrupólu): m 2 eUarr „ l 2eUac Pro danou délku kvadrupólu, l, musí být napětí Uacc dostatečně malé, aby iont strávil v kvadrupólu desítky - stovky cyklů o frekvenci w během doby průletu t. • Zvýšení rozlišení též přesnější mechanickou výrobou. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 160 z m z Rozlišení ... je voleno hodnotou směrnice skenovací přímky (a/q) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 158 Kvadrupólový filtr Externí zdroj • problémy s okrajovým polem (fringe field), nestabilní dráhy; významné % iontů se nedostane dovnitř • hmotnostní diskriminace - těžké ionty, které stráví delší dobu v okrajovém poli, jsou více ovlivněny • řešení: - vstupní elektrostatická čočka - vstupní RF kvadrupól (q), hexapól nebo oktapól (pouze RF složka: a = 0, U = 0 neselektivní filtr propouštějící všechny m/z ... iontový vodič ) Trojitý kvadrupól (QqQ) • populární tandemový hmotnostní spektrometr pro CID • prostřední kvadrupól (q, pouze RF složka) slouží jako kolizní cela Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 161 Vlastnosti kvadrupólového filtru Zaznamenávání spektra r a fobvykle konst., současné skenování U a V při konst. U/V. Limit max. hmotnosti 2 000 - 4 000. max(mZ)~ 0fV [V, cm, MHz] Zýšení limitu m/z : VÍ, ri, fi. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 159 Kvadrupólová iontová past (Ion trap, IT) 1953 Wolfgang Paul (Paulova past) - téměř bez povšimnutí 1983 Finnigan - komerční přístroj (dnes nejprodávanější MS) Schema iontové pasti Bruker, Model ESQUIRE-LC DC AC DC Opťmiied Aspptote Angle DC: stejnosměrné napětí nebo zem AC: stejnosměrné + střídavé napětí, U + Vcos(wt) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 162 27 Potential Energy Diagram for LCO I -50 -150.00 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 163 Iontová past • Experiment zahrnuje fáze ionizace, akumulace, sken a detekce. • Akumulace ionů: ionty lze sbírat i během ionizačního pulsu - výsledkem jsou velmi nízké detekční limity. Doba cyklu akumulace - detekce závisí na požadavcích: Vyšší citlivost ... delší akumulace. Širší rozsah m/z, vyšší m ... delší sken. Vyšší R ... pomalejší sken. • Rezonanční vypuzení (resonant ejection) iontů o specifické m/z - přivedením přídavného RF signálu na víčka pasti. Vytvoření "díry" v oblasti stability. (1983, G. Stafford: "mass selective instability mode") • Pufrovací plyn (o nízké hmotnosti: He, 1 mTorr) Mnohem lepší výsledky než pouze pro samotný analyt. Srážky analytu s pufrovacím plynem vedou k lepší distribuci energie mezi molekulami analytu. Výhodné pro spojení GC-MS. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 166 Iontová past • MS/MS - past může nahradit tandem dvou spektrometrů srážkově indukovaná (aktivovanou) disociace, většinou s He CID, CAD: collisionally induced (activated) dissociation • Vysoké R ... v praxi < 10 000, obvykle ~ 5 000 • Max. hmotnost, m/zmax ~ 70 000 (rezonanční vypuzení) • Miniaturizace: iontová mikropast, past na čipu (i pro kvadrupólový filtr) + celková velikost 1 cm + vhodné např. pro vesmírný výzkum - mnohem náročnější tolerance, obtížná výroba - horší parametry (R, m/zmax ) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 16i 28 Iontová past Iontová transmise polovina iontů může být detegována Fyzická omezení volba rozměrů, napětí a frekvence omezena. Maximální dynamický rozsah (106 pro 1 druh iontu) omezen: - minimum citlivostí (i 1 iont může být detegován) - maximum max. množstvím lapených iontů: pro vyšší množství iontů než 106 přestává past postupně fungovat - vzájemné odpuzování iontů. Pozor, jde o sumu iontů všech m/z ! Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Lineární past s axiálním vypuzením skimmer Aux AC úrHicB y N7 CAD Gas J * Exit lens J QC ill II 01 l|l 02 ll 1 Q3 1 I Hl II Ml "I 1 ' LI N AC linear ion trap 3x10-5 TOU lonty jsou vypuzeny z LT podél osy kvadrupólu. (Zdroj: J. C. Y. Le Blanc et al. Proteomics S, 2004, 859-869.) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 172 1S9 Výhody 2D vs. 3D pasti Účinnost zachycení: 50-75% (3-D: 5 % - 20%, a závisí na hmotnosti) Účinnost extrakce: 25-50% (3-D : 20%) Citlivost: 5-10 - násobný vzrůst Iontová kapacita: 20 - 30 x vyšší než u 3-D Lineární rozsah vzrostl o více než 2 řády až na 106 Rozlišení: ~10 000 při rychlosti skenu 300 a.m.u./s Širší možností manipulací s ionty (akumulace, skeny...) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 173 29 Srovnáni kvadrupólových analyzátorů QIT QQQ LQIT Citlivost ++ - ++ Dynamický rozsah - ++ + Rozsah m/z - + + MS3 ++ - ++ Neutral loss sken/Precursor sken - + + Správnost m/z + - + Rozlišení + - + Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 175 FT-ICR-MS Pohyb iontu v magnetickém poli: Bzev = + + + B Úhlová (cyklotronová) frekvence: = v = Be Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 178 Lineární past Lineární past neboli "2D past" vychází z kvadrupólového filtru/iontového vodiče. Iontová past popsaná dříve je někdy označována jako "3D past". Ionty jsou injektovány do RF (RF-only) kvadrupólu a poté zadrženy zvýšením potenciálu na postranních víčcích, takže oscilují v potenciálové jámě kvadrupólu. Později jsou ionty postupně vypuzovány otvory v tyčích nebo víčcích a detekovány. Dva způsoby vypuzení iontů z LT: A. Schwartz, J.C., Senko, M.W., Syka, J.E.P., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 , 2002, 659. B. Hager, J.W., Rapid Comm. Mass Spec. 16, 2000, 512. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 176 Vlastnosti FT-ICR-MS - (supravodivý) magnet s velkou magnetickou indukcí B ~ 10 Tesla - velmi nízký tlak, p < 10-7 Pa (UHV, ultra high vacuum) - vysoká cena ~ 25 000 000 Kč - omezený dynamický rozsah ~ 103, 100 až 105 iontů + velmi vysoká přesnost a správnost m/z, ~ ppm + velmi vysoké rozlišení, R ~ 106 + multiplexová (Fellgettova) výhoda FT ... všechny m/z se měří po celou dobu =i> zlepšení S/N 103x, zvýšení rychlosti získávání 106x + vhodné k MSn (CID, CAD), běžně n = 2 až 3, demonstrováno i n = 1 Další geometrie pasti: cylindrická, hyperbolická (Penningova) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 179 Iontový cyklotron (FT-ICR-MS) (Fourier transform - ion cyclotron resonance - mass spectrometer) ...typ iontové pasti Kubická past tvořena dvěma páry elektrod a dvěma víčky B ,—o excitace detekce Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 x y 177 30 Princip FT-ICR-MS Ionizace pro FT MS 1. ionizace uvnitř: analyzátor = zdroj (např. EI, LDI) 2. externí zdroj a zavedení do cely - iontové vodiče, kvadrupóly, elektrostatická čočka - diferenciálně pumpované cely (iont se tvoří v první cele při vyšším tlaku a poté je zaveden do detekční cely otvorem podél osy z) Excitace 1. Impuls ... vysoká amplituda, krátké trvání 2. Chirp ... rychlý sken frekvencí v požadovaném intervalu frekvencí 3. SWIFT ... Stored Waveform Inverse Fourier Transform excitační profil získaný iFT zvoleného profilu miz (iFT = inverzní FT, transformace z frekvenční (miz) do časové domény) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 81 Princip FT-ICR-MS Detekce 1. indukční - ionty indukují náboj v detekčních destičkách při průletu okolo: nedestruktivní detekce (FT cyklotron) 2. destruktivní - ionty narazí do detekčních destiček (prostý cyklotron) Záznam dat • vyšší frekvence vzorkování =i> vyšší horní limit miz. Nyqistovo kritérium: nejvyšší detegovaná frekvence = vzorkovací frekvencei2 • delší doba záznamu, t =i> vyšší rozlišení a nižší dolní limit miz. • Důsledek ... nutnost uchování velkého množství dat - heterodyne, frekvenční směšovač (frekvenční posun signálu směrem dolů umožní použít nižší vzorkovací frekvence) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 182 Hmotnostní spektrometr budoucnosti? ... neexistuje jediné nejlepší řešení Trendy • Ústup magnetických sektorů • Hybridní spektrometry Rozšiřování moderních spektrometrů a jejich hybridů (iontové pasti, ortogonální TOF analyzátory). • Nové spektrometry Elektrostatická past "Orbitrap" Lineární pasti kvadrupólového typu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 185 Princip FT-ICR-MS Z-trapping • Na víčka je vloženo napětí 1-5 V, aby ionty neopustily past ve směru osy z. • V přídavném poli dochází k oscilaci iontů a rozštěpení původně jediného pohybu na pohyb cyklotronový a magnetronový. Důsledkem jsou komplikovanější kalibrace, posun píků a vyšší ztráta těžších iontů. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 183 31 Vlastnosti Orbitrapu Průletový analyzátor (Time-of-flight MS, TOFMS) + Velmi vysoké rozlišení jako u FT-ICR-MS (R = 50 000 - 500 000). Princip: m/z vypočten z doby letu iontů + Velmi vysoká přesnost a správnost ... jako u FT-ICR-MS. 1. Urychlení iontů Stejná urychlovací energie pro všechny ionty W(el.) + Nepotřebuje magnet. W(el.) = W(kin.) + Nepotřebuje RF generátory. 2. Drift (let) iontů: separace iontů podle miz W(kin.) = mv2i2 - Vyžaduje velmi nízké tlaky . jako FT-ICR-MS. 3. Záznam iontového signálu v čase, l(t) 4. Stanovení miz doby letu: transformace l(t) —l(miz) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 187 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 190 Lineární elektrostatická past pohybující se elektrony indukují proud Detekovaná frekvence = f(m/z) Benner, Anal. Chem. 1997, 69, 4162-4168 Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 iSS Historie TOFMS 1946 princip TOF W. E. Stephens, Phys. Rev., 1946, 69, 691 1948 první TOF spektrometr (ion velocitron) A. E. Cameron, D. F. Eggers, Rev. Sci. Instrum. 1948, Í9, 605 1955 iontový zdroj se 2 stupni; zpožděná extrakce (time-lag focusing) Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 26, 1150 1973 iontové zrcadlo B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, and V. A. Zagulin, Sov. Phys. JETP 1973, 37, 45 1995 pulsní extrakce („time-lag focusing" v praxi) Whittal, R. M.; Li, L., Anal. Chem. 1995, 67, 1950-1954 Brown, R. S.; Lennon, J. J., Anal Chem. 1995, 67, 1998-2003 Vestal, M. L.; Juhasz, P.; Martin, S. A, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1995, 9,1044-1050 Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 i9i 32 Time-of-Flight hmotnostní spektrometr (TOFMS). Metody zv rozlišení TOF MS (reflektor, zpožděná a ortogonální extrakce). Princip TOFMS 1. Pulsní ionizace (doba pulsu ~ ns): rychlé vytvoření obláčku iontů (EI, LD, MALD, PD ...) 2. Extrakce a urychlení iontů v elektrickém poli 3. Separace iontů v driftové zóně při E = 0 (field-free region, flight tube) 4. Detekce iontů, záznam signálu, transformace do m/z domény ui ,( mv2 urychlovací energie zeU = —^ kinetická energie L--■ v = j___ délka driftové zóny doba letu S m = 2 e U íl z L2 (m/z)1<(m/z)2 Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 t 196 Geometrie TOFMS TOF MS s iontovým zrcadlem (reflektorem) ... dosažení lepších parametrů spekter ... možnost strukturní analýzy (PSD) iontový zdroj: např. pulsní e- svazek, laserový puls (+) odpuzovací elektroda (repeller), ~20 kV reflektor, detektor >20 kV (+) driftová zóna (E = 0) mřížky "=■ zdroje iontový (+) deflektor J_ mřížky a ~ elektrody reflektoru Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Princip TOFMS Přesnější vztah zahrnuje i čas strávený v prostoru iontového zdroje a detektoru: napětí: Us 0 0 Ud Xtof = ts + Xl + td 2ms2 , \ zeUs mL2 2zeUs Pozn.: 1) ts, tL, td a tedy i tT0F jsou přímo úměrné (m/zjí/2 2) pro hrubý odhad tT0P tT0F ~ tL (L >> s, d) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 vzdálenosti: L d s (-) 194 197 33 Principiální výhody a vlastnosti TOFMS Reálný zdroj iontů pro TOFMS • Teoreticky neomezený rozsah m/z Ionty jsou charakterizovány distribucemi: doby vzniku t0, • Ideální pro pulsní ionizaci místa vzniku xo, yo, Zo, počáteční rychlosti Vo (energie w^o), • Fellgettova výhoda: pro každý puls zaznamenáno celé spektrum, není a směru pohybu a (odchylka od osy letu x). třeba skenovat Důsledek: snížení rozlišení, R • Velmi krátká doba záznamu spektra (-10^ s) Wiley-McLarenův zdroj pro plynné vzorky: • Vysoká propustnost iontů ... předpoklad vysoké citlivosti nastavením napětí na střední mřížce umožňuje kompromis distribuce v a x za účelem dosažení optimálního rozlišení • Jednoduchost (Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 26, 1150) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 199 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2o2 Iontové zdroje pro TOFMS 1. Zdroj pro plynné vzorky e-, ionty, laser . (+) (-) 2. Zdroj pro tuhé vzorky (desorpce) laser, ionty, atomy . /j (+) (-) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2oo Ideální zdroj iontů pro TOFMS Všechny ionty jsou vytvořeny: • v čase to (doba tvorby, At = 0) • ve vzdálenosti Xo (x ... osa letu TOFMS) (nejlépe v jednom bodě [Xo, yo, zo]) • se stejnou rychlosti (, která nemusí být nulová,) podél osy x. (nejlépe s Vyo = o a Vzo = o) zdroj detektor Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2o1 Vlastnosti iontů Př.: Distribuce počáteční rychlosti iontů při MALDI (Pv... pravděpodbnost výskytu molekuly s počáteční rychlostí Vo) 0 1000 2000 Vo (m/s) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2o4 34 Pulsní tvorba iontů pro TOFMS Extrakce konstantním elektrickým polem (DC) pulsní ionizační paprsek + konstantní extrakční pole 2a. Pulsní extrakce, zpožděná extrakce (pulsed extraction, PE; delayed extraction, DE) pulsní ionizační paprsek + pulsní extrakční pole 2b. o-TOFMS s pulsní extrakcí (orthogonal extraction, kolmá extrakce) souvislá tvorba (přívod) iontů + pulsní extrakční pole Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 206 Jak zvýšit rozlišení (MALDI-TOFMS)? 1. Vysoké extrakční napětí v lineárním TOF MS. 2. Reflektor. 3. Pulsní extrakce. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 207 35 Konstrukce reflektoru Lineární reflektor ... E je konstantní podél osy reflektoru Jeden stupeň ... intenzita elektr. pole, E je konstantní v celém reflektoru (Alikhnov) Dva stupně ... reflektor je rozdělen na 2 zóny s různou E (B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, V. A. Zagulin, Sov. Phys. JETP 1973, 37, 45) Nelineární reflektor ... E se mění podél osy reflektoru Kvadratické pole (D. R. Jardine, J. Morgan, D. S. Alderdice, P. J. Derrick, Org. Mass Spectrom. 1992, 27, 1077) Zakřivené pole (T. J. Cornish, R.J.Cotter, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1037-1040) + dřívější patenty (Japonsko, SSSR) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Reflektor s jedním stupněm detektor rl 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i reflektor s L1 (+) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tof = ts + tL + t, . součet časů ve zdroji, driftové zóně a reflektoru = = to a 2 V a to Mi+L+2a L = L1 + L2... driftová zóna, E=0 a ... zrychlení ve zdroji, a=qEs/m ar... zrychlení v reflektoru, a=qEr /m (Moskovets, E. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 150-155) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 214 +... 211 Konstrukce reflektoru R1 R1 R1 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 ! i i i i i ! i i i i i i i -L (U2) i i ! Ü3>Ü1 mřížky: definice ekvipotenciálové plochy prstence: elektrické stínění stěn vakuového systému potenciál na prstencích definován sérií rezistorů Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 212 Reflektor se dvěma stupni Reflektor se 2 stupni ... reflektor je rozdělen na 2 zóny s různou E Pro kladné ionty: s pozitivním potenciálem na prostřední mřížce, 0 > U2 > U3 ■ různá uspořádání s poměry délek stupňů ~1:2, ~2:3 aj. ■ použití krátkého 1. stupně s vyšší intenzitou elektr. pole umožňuje zkrátit celkovou délku reflektoru s negativním potenciálem na druhé mřížce: - vytvoření prostorového zaostření v prvním stupni ■ různá hloubka průniku v druhém stupni (energetické zaostření) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 215 216 36 Reflektor se dvěma stupni + Vhodné pro energetickou disperzi do -20%. Např. pro energetickou disperzi 5% teoretické rozlišení až -100 000 - Pouze ionty, které proniknou do hloubi reflektoru (85-100%) jsou zaostřeny. - K získání spektra iontů s vyšší energetickou disperzí je třeba zaznamenat sérii spekter pro několik hodnot potenciálu reflektoru a výsledné spektrum složit z kusů těchto spekter. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Reflektors nelineárním polem nelineární (zakřivené, kvadratické) pole lineární pole (T. J. Cornish, R. J. Cotter "Non-linear field reflector", US Patent 5 464 985) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 220 Reflektor s nelineárním polem Cíl: řr0FPro ionty všech m/z nezávislý na jejich Wkm V kvadratickém poli U{z) = ^{z-af + C r Tnp lion i' odraz iontu ^ f(Wkjn0) z ... osa změny potenciálu a ... minimum paraboly k a C... konstanty f... frekvence oscilací (Převzato z: A. A. Makarov, E. N. Raptakis, and P. J. Derrick, int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1995, 146/147, 165.) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 21 Reflektors nelineárním polem Zpravidla kvadratické pole nebo jeho aproximace Tvorba nelineárního pole I pomocí nestejných rezistorů v sérii 1 1 pomocí nestejných odstupů mezi prstenci či mřížkám i i i i i i i i i i + současné zaostření iontů s širokou disperzí Wkín, jako např. produktů rozpadu za zdrojem PSD, pro všechny m/z - složitější kalibrace - ideální jen pro ionty pohybující se po ose reflektoru ... v praxi omezené R Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Reflektor s nelineárním polem Další prakticky využitelná pole: osově symetrický hyperbolický potenciál planární hyperbolický potenciál osově symetrický hyperlogaritmický potenciál Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 3. Pulsní (zpožděná) extrakce Pulsed (delayed) extraction, Time-lag focusing Opožděné zapnutí extrakčního napětí: 1. Puls laseru {t= 0) 2. Expanze iontů při vypnutém extrakčním poli po dobu r(delay) 3. Rychlé zapnutí extrakčního pole (t= z) V 15 kV 12 kV 0 \/(destička, repeller) V( mřížka) 0 t t (Brown, R. S.; Lennon, J. J.; Anal. Chem. 1995, 67, 1998) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Pulsní (zpožděná) extrakce repeller mřížky driftová zóna detektor 1. t = 0: © E = 0 např. 2. t = t: 12 kV 12 kV 0 kV E > 0 3. např. 15 kV 12 kV 0 kV t = toŕ: © © Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 223 Další faktory ovlivňující rozlišení TOFMS • neideální ion tový zdroj • iontová optika • dilatace letové trubice • vlastnosti detektoru • vzorkovací frekvence AiD převodníku • příprava vzorku • stabilita urychlovacího napětí Př. vliv kolísání urychlovacího napětí: , ,in ni dm .(dU dt m = const. Ut2 => R 1 =-= const\ — + 2— I dt dáno max. frekvencí AD převodníku, rychlostí detektoru a časovou disperzí tvorby iontů dU určeno drifty a kolísáním zdroje vysokého napětí Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 225 Vliv mřížek Mřížky ... elektrody transparentní pro ionty ... v iontovém zdroji, reflektoru a před detektorem MS s mřížkami + přesná definice potenciálu - ztráty na mřížkách (náraz, odklonění, reakce) - tvorba sekundárních iontů z materiálu mřížek MS bez mřížek - vyšší rozlišení, beze ztrát na mřížkách - komplikovanější návrh (extra zakřivení drah iontů jako u čočky) Více podrobností např. v: T. Bergmann, T. P. Martin, H. Schaber Rev. Sci. Instrum. 1989, 60, 347. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 228 38 Další parametry TOFMS Vlastnosti TOFMS Terčík (MALDI): až 384 vzorků na terčíku o velikosti titrační destičky, 1. Max. m/z teoreticky neomezená. Praktický limit: účinnost ionizace a dostatečná plocha pro sběr eluentu z několika separací detekce, rozklad iontů během letu. Axiální ozáření vzorku laserem => vyšší rozlišení 2. Celé spektrum je zaznamenáno najednou 3. Vysoká rychlost záznamu spektra (desítky ms). Kolizní cela v iontovém zdroji => zvýšení výtěžku fragmentace Př.: inzulín (m/z = 5735) urychlený 15 kV překoná 1-metrovou driftovou zónu za ~ 50 jms. Délka driftové zóny (letové trubice): typicky 1-2 m, ale i 10 cm nebo 5 m 4. Vysoká propustnost iontů (desítky %). Iontový vodič - může být umístěný v trubici pro zvýšení propustnosti iontů 5. Vysoké rozlišení (R > 10 000). Detektor: mikrokanálková destička (MCP) 6. Jednoduchost a relativně nízká cena. elektronové násobiče 7. Dostupné techniky pro MS/MS hybridní detektory (scintilační vrstva + fotonásobič) Detekční elektronika: AD převodník (8 bitů, 0.5 - 4 GS/s) TD převodník + segmentovaný detektor Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 229 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 232 MALDI analýza početných sérií vzorků 1, 10, 96, 100, 384, 1536 ... vzorků/terčík Shrnutí výhod TOF MS Výhodné vlastnosti max. m/z, rychlost a počet analyzovaných vzorků za čas, transmise, rozlišení, relativně nízká cena Obrovský rozmach TOF MS v poslední dekádě MALDI + PE TOF, rTOF MS API + oTOF MS Nové techniky pro MSiMS (TOF-TOF, LIFT, QTOF) Konkurenční techniky LT, FT-ICR a hybridní MS Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 233 Srovnání rozlišení systemů TOFMS systémgeometrie extrakce R TOFMS lineární DC 500 DE-TOFMS lineární pulsní 5 000 rTOFMS reflektor DC 10 000 DE-rTOFMS reflektor pulsní 20 000 orTOFMS reflektor pulsní 10 000 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 231 Srovnání běžných hmotnostních spektrometrů MS max. m/z R kvuadrupólový filtr 4 000 2 000 magnetický sektor 20 000 50 000 ion tové pasti 10 000 5 000 FT-ICR-MS 100 000 100 000 TOFMS 1 000 000 10 000 Pozn: Hodnoty v tabulce jsou pouze přibližné a vztahují se k běžným přístrojům, parametery některých vědeckých nebo nových komerčních přístrojů mohou být výrazně vyšší (i řádové odchylky). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 234 39 Simulace pohybu iontů • Exaktní výpočet pohybu iontů složitý i pro poměrně jednoduchá elektrická a magnetická pole. • Simulace iontového pohybu: program Simion Postup při řešení konfigurace iontové optiky pomocí progamu Simion: 1. Zadání geometrie (nákres elektrod). 2. Zadání potenciálů elektrod, definice magnetického pole. 3. Definice iontů (počet n, v0, x0, y0, z0, a0, f0 ). 4. Simulace =i> výsledek (grafická reprezentace, text). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Sken: záznam hmotnostního spektra S(m/z) = f(X) = f(t) Skenující přístroje magnetový sektor (B) kvadrupólový filtr (Q) iontové pasti (IT, LT) Skenovaná veličina Doba skenu B, U ~ 1 s U+V, f ~ 0.1 s U, V, f ~ 1 s Neskenující přístroje (přímý záznam signálu v čase): průletový analyzátor (TOF) ~ 100 ms iontový cyklotron (FT-ICR) ~ 1 s orbitrap (O) ~ 1 s Další neskenující přístroje mohou používat plošné detektory (array). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 235 238 Simion Příklad: Simulace elektrostatické čočky pomocí programu Simion. Čočka: 3 segmenty průměr, d = 36 mm délky segmentů, y1 = 28 mm, y2 = 26 mm, y3 = 32 mm mezery mezi segmenty, l = 2 mm počátek v xyz [0, 0, 0] mm potenciály, U1 = 0; U2 = proměnné; U3 = 0 Ionty: počet, n = 5 hmotnost, m = 100 kinetická energie, W0 = 100 eV souřadnice xyz [0, -30, 0] mm 00(1) = (-4 + 2/)o , kde i = 0 ... n - 1 Úkol: Ověřte funkci čočky při napětí na prostředním prstenci, U2 = 0, 85, 100, 120 a 133 V. Řešení: Viz přílohy Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 236 Jednoduchá hmotnostní spektrometrie Záznam „celého" spektra ... „Kompletní" inrormace www.jimkeiiyjr.com/2008_07_01_archive.htmi Záznam části spektra (zoom scan) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 239 40 Tandemová hmotnostní spektrometrie Analýza iontů fragmentace analýza iontů III Qi m ^2 m Q3 MS1 CID ionty prekurzorů mateřské ionty precursor/parent ions produktové ionty dceřinné ionty product/daughter ions Klasický přístroj pro nízkoenergetickou CID: trojitý kvadrupólový filtr (triple quad, TQ, QQQ, QqQ, Q3) Qr 1. analyzátor (MS1) kolizní cela (pouze RFQ) Q3: 2. analyzátor (MS2) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Př.: skenování produktových iontů MS-MS Fragmentation Patterns of Cholesterol Oxidation Products B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf Monatsh Chem 138, 437-444 (2007) APCI QqQ toxikologický relevantní produkty oxidace cholesterolu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Základní typy skenů v MS/MS Skenování iontů produktů, dceřinných iontů Product ion scan, daughter ion scan, fragment ion scan Nastavení MS1, skenování MS2 2. Skenování iontů prekurzorů, výchozích látek, mateřských iontů Precursor ion scan, parent ion scan Skenování MS1, nastavení MS2 3. Skenování ztráty neutrální částice Neutral loss scan Skenování MS1 a MS2 zároveň, Am/z = konst. 4. Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí Selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring Nastavení MS1 a MS3 na vybrané m/z Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Př.: skenování produktových iontů FIS, i Dau-htLT kms dť irh.iUjslLinťlrid. cfTHůl): lOO^e/rni'. KM APCI I : W0-500 rn/rlV,^, MľnilA d au i; hlt-r iuri síran: 40-400 m/z Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 245 Skenování produktových iontů (Product ion scan) Nastavení MS1: propustit ionty o vybrané m/z Skenování MS2: spektrum produktů vybraného prekurzoru ... užitečné při objasňování struktury ... fingerprint analyzované sloučeniny . zjednodušení spektra ... zvýšení poměru signálu k šumu (S/W) ... pozor: MS1 není zárukou izolace jediného výchozího iontu MS" ... hmotnostní spektrometrie n-tého stupně Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Skenování iontů prekurzorů (Precursor ion scan) Skenování MS1: spektrum iontů prekurzorů Nastavení MS2: detekce produktových iontů o dané miz . pro identifikaci skupiny podobných sloučenin, sloučenin s totožnou funkční skupinou či strukturním motivem . zjednodušení spektra ... zvýšení Si/V Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 41 241 244 242 243 246 Př.: skenování ztráty neutrální částice 1 Constant neutral loss scanning for the characterization of bacterial OH.' phospholipids desorbed by fast atom bombardment J J D. N. Heller, C. M. Murphy, R. J. Cotter, C. Fenselau, O. M. Uy ft Anal Chem 60, 2787 - 2791 (1988) „.„ PE v PG v. fosfoethanolamin: Am/z = 141 LPG \. "Mosfoalycerol: Am/z = 172 -iiaamt PI \ \ methylfosfoethanolamin: Am/z = 155 -CH, CM,'4H.H) MMPE -»,,„,.«„,), DMPE Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 25o Př.: skenování ztráty neutrální částice ; HillifcL B o XIC: MS @ 7Q1 "cg - a _ há 2 Ě .c o w H s ■ 'E ■äe o ■ MS @ 19,B min rádZ L..L Kredit: Zbyněk ,w su an TL ■ 56 j ■ i-__---....._—.__ * _._ Spojení MS s chromatografickými technikami (MS chromatogram, ion chromatogram) ... záznam intenzity iontu(ů) v průběhu separace Celkový iontový proud (Total ion current, TIC) ... monitorování širokého intervalu miz (stovky a.m.u.) ... vhodný pro celkový obrázek o chromatografii a nalezení nových píků ... nevhodný při analýze komplexních směsí Monitorování vybraného iontu (Selected ion monitoring, SIM) . detekce při vybrané miz ... pro experiment navržený pro monitorování pouze vybraného iontu ... pro více iontů peak switching Monitorování vybrané reakce (Selected reaction monitoring, SRM) ... analogie SIM s využitím tandemové MS ... pro více rekcí multiple reaction monitoring, MRM Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 2 Př.: Monitorování více reakcí, MRM B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf Monatsh Chem 138, 437- 444 (2007) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 257 Spojení MS s chromatografickými technikami Při vícerozměrných analýzách (LC-MS, GC-MS, CE-MS) jsou často zaznamenávána celá spektra v průběhu separace. Z těchto dat pak může být získán celkový proud, průběh intenzity pro daný miz Extracted ion chromatogram, XIC, EIC Reconstructed ion chromatogram, RIC „Rekonstruovaný" chromatogram je obvykle horší kvality než „pravý" SIM, resp. MRM získaný na Q, resp. QqQ Base peak intensity chromatogram, BPC ... intenzita dominantního píku vs. retenční čas ... může vypadat přehledněji než TIC díky ignorování sumy minoritních píků Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Př.: HPLC - APCI - SRM SRM pro dominantní reakce z předchozí tabulky Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 255 25S 43 Př.: HPLC - APCI - MRM ľíp. f. M KM Lhn.mjU.-iTiir o ť J slurnlnnJ iriixlurr I? LOrü und I'MiyJnwytriulritcmJ Iht praspective intrmzl sUiiilanl) ilHlanľJiirdt ftJOIJ ^.'im'. ítlrama Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 259 Hmotnostní spektrometry pro MS/MS Trojitý kvadrupólový filtr (QqQ) Iontové pasti (IT, LT, O, FT ICR) Dvojitý magnetický sektor s obrácenou geometrií (BE, MAG-ESA) Průletový analyzátor (TOF) Hybridní spektrometry - kombinace výše uvedených, např. LT - FT ICR Klasifikace tandemové spektrometrie fragmentace v prostoru: 1, 3, 4, 5 fragmentace v čase: 2 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 262 MRM: TIC a XIC (A) TIC pro několik vybraných peptidů alkoholdehydrogenázy (B) XIC specifického peptidu alkoholdehydrogenázy, prekurzor: z = 3 (C) XIC specifického peptidu alkoholdehydrogenázy, prekurzor: z = 2 (navíc standard pro kvantifikaci) A multiple reaction monitoring method for absolute quantification of the human liver alcohol dehydrogenase ADH1C1 isoenzyme D. J. Janecki, K. G. Bemis, T. J. Tegeler, P. C. Sanghani, L. Zhaib, T. D. Hurley, W. F. Bosron, M. Wanga, Anal.Biochem. 369, 18-26 (2007) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 260 Skenování v MS/MS Objasnění struktury organických sloučenin Analýza směsí analytů jako náhrada spojení separace - MS • Při MS/MS se všechny analyty ionizují současně, izoluje se jeden analyt po druhém (MS1) a po fragmentaci (CID) se identifikují (MS2). • Pozor! U složitých směsí dochází k vzájemnému rušení při ionizaci. Zlepšení poměru signálu k šumu, S/N • Zvýšení selektivity =i> snížení šumu • Zjednodušení spekter • Všechny druhy skenů MS/MS • Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 26i Další hmotnostní spektrometry pro MS/MS Tandem kvadrupólová iontová past - TOFMS (IT-TOFMS) IT: možnost akumulace a MS" v prvním stupni. TOF: citlivý detektor s vysokým rozlišením jako koncový stupeň. Iontové pasti: kvadrupólová IT a FT-ICR-MS možnost MS" tentýž spektrometr jako pro MS, pouze jiný software Postup: izolace výchozího iontu (po akumulaci všech iontů) excitace výchozího iontu (zvýšení amplitudy) po delší dobu sken produktů (případně zpět k bodu 1 pro MS", n >2) Tandem LT - FT-ICR-MS mnoho možných režimů skenů Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 264 44 Typy disociace Disociace ... monomolekulární reakce, ŕ(indukce) « ŕ(disociace) Fragmentace může být způsobena: 1. Kolizí s atomem nebo molekulou kolizně indukovaná disociace (collision-induced dissociation, CID) 2. Kolizí s povrchem povrchem indukovaná disociace (surface-induced dissociation, SID) 3. Fotonem - fotodisociace (photodissociation, PD) např. infrared multiphoton dissociation, IRMPD 4. Elektronem disociace v důsledku záchytu e- (electron capture dissociation, ECD a electron transfer dissociation, ETD) Pozn.: Určení hlavní příčiny fragmentace někdy není jednoznačné, např. fragmentace během MALDI (ISD and PSD) může být indukován jak fotony, tak i kolizemi. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 265 Srážky iontů Fragmentace • cílená fragmentace za účelem studia struktury iontu • obvykle s molekulami vzácných plynů - He, Ar Elastické srážky Kinetická energie zůstává zachována. Neelastické srážky Část kinetické energie se po srážce přemění na vnitřní energii iontu: Ein <= E(M/(Mř + Mi)) t = terčík (target), i = ion Těžší terčík =i> možné přenést více energie na iont 1 eV/iont ~ 100 kJ/mol (100kJ/5 g oplatků) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 268 Typy disociace 1. srážky s molekulami okolního plynu v kolizní cele při zvýšeném tlaku, p ~100 Pa CID/CAD collisionally induced/activated dissociation 2. srážky s povrchem: SID, surface induced dissociation - povrch: vrstva organické látky (polymer nebo monovrstva malých organických molekul, např. alkanthiolů) na vhodném substrátu (Au) - srážky v důsledku urychlení el. polem, př.: napětí nozzle- skimmer 3. fotodisociace RMPI, resonant multiphoton ionization 4. záchyt elektronu ECD, Electron capture dissociation ETD, Electron transfer dissociation 5. nadměrná excitace při ionizaci (např. vysoká energie při LDI a MALDI) ISF, in-source fragmentation (fragmentace ve zdroji) ... v TOF MS PSD, post-source decay (rozklad vně zdroje) ... v TOF MS Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 266 Nízkoenergetické srážky iontů Energie srážek: 1 - 1OO eV vibrační charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-14 s Účinnost srážek obvykle dostatečná díky mnoha srážkám iontu v kolizní cele Instrumentace trojitý kvadrupólový filtr, iontové pasti, hybridní přístroje V současnosti nejrozšířenější technika, nízkoenergetická CID Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 26Q Stabilita iontů 1. Stabilní: poločas rozpadu, t> 10-6 s Iont prolétne celým MS, aniž by se rozložil. 2. Metastabilní: poločas rozpadu, t~ 10-7 - 10-6 s Iont se rozládá v průběhu letu hmotnostním spektrometrem. 3. Nestabilní: poločas rozpadu, t< 10-7 s Iont se rozloží ještě ve zdroji. Historické rozděiení - časy podle doby pobytu v magnetickém sektoru Reakce: unimolekulární, bimolekulární Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 26T Vysokoenergetické srážky iontů Energie srážek: keV elektronový charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-15 s přeměněná energie ~ 1 - 3 eV Účinnost srážek He - snižuje úhlový rozptyl produktů Ar, Xe - umožňuje účinnější konverzi energie Instrumentace hybridní sektorové přístroje, TOF-TOF Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 2T0 45 Příklad: McLaffertyho přesmyk Štěpení karbonylových sloučenin s vodíkem v g pozici na enolický fragment a olefin indukované EI: F. W. McLafferty, Anal. Chem. 31, 82 (1959). D. G. I. Kingston et al., Chem. Rev. 74, 215 (1974); K. Biemann, Mass Spectrometry (New York, 1962) p 119; Djerassi et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 817 (1965); 91, 2069 (1969); 94, 473 (1972) M. J. Lacey et al., Org. Mass Spectrom. 5, 1391 (1971); G. Eadon, J. Am. Chem. Soc. 94, 8938 (1972); F. Turecek, V. Hanus, Org. Mass Spectrom. 15, 8 (1980). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 271 Mechanismus McLaffertyho přesmyku CH," 'CH, miz 58 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 272 ECD, ETD Electron capture dissociation • interakce iontů s termálními elektrony (nízká E) • aplikace: fragmentace peptidů (ionty c, z ), nevede k fragmentaci bočního řetězce • FT-ICR-MS Electron transfer dissociation • transfer elektronu z reagentu • tentýž charakter fragmentace jako ECD • kvadrupólové pasti (Syka J.E.P,. Coon J.J., Schroeder M.J., Shabanowitz J., Hunt D.F. PNAS 101, 9528-9533, 2004) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 273 Fragmentace ve zdroji In-Source Fragmentation (ISF), In-Source Decay (ISD) Využívaná zejména v MALDI TOFMS peptidů. Zvýšení energie laseru při MALDI vede k nadměrnému "zahřátí" molekul/iontů analytu (vibrace) a fragmentaci analytu přímo v iontovém zdroji. Intenzita fragmentů << intenzita mateřského iontu ([M+H]+). Pulsní metody (Delayed Extraction) nutné pro: dosažení dostatečné citlivosti prodloužení délky pobytu iontů v iontovém zdroji (více srážek). Převážně monomolekulární reakční mechanismus (narozdíl od CID). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 276 46 ISD. Analyt: 20 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N2. (V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410-4416, 1998.) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 278 Fragmentace za zdrojem Prekursor ABC+ Fragmentace 1 Fragmentace 2 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 'ABC+V y "'AB+V y "'A+v 2 2 2 v v v v v BC 281 47 MALDI PSD peptidu MALDI PSD - reflektor se 2 stupni. (Zdroj: Z. Zdráhal) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 ^0 QTOFMS: hybridní TOF MS Využití výhod obou analyzátorů Q: vhodné pro 1. MS, jako kolizní cela a pro úpravu iontového svazku TOF: dobré parametry pro 2. MS Výměnný iontový zdroj oddělení ionizace od analyzátoru vhodné pro kontinuální, kvazikontinuální i pulsní ionizační techniky Př.: QTOFMS: API (kontinuální iontový zdroj) AP MALDI (pulsní, kvazikontinuální iontový zdroj) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 285 288 48 LIFT TOF MS MS-MS s využitím TOF principu, dokonalejší PSD (LIFT) zdroj 6 kV B: LIFT cela 15 kV (puls) trubice s mřížkami vstupní mřížka j výstupní i mřížka 15 kV (puls) Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 22 kV reflektor lIFT cela: 292 Hybridní instrument pro API a MALDI Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 290 Ion mobility spectrometry (IMS) 1970 Cohen, Karasek Charakteristika • Technika na pomezí hmotnostní spektrometrie a chromatografie • Separace v důsledku tření iontů s okolním prostředím • Ionty neseparovány podle miz, ale podle své mobility • Dokáže rozlišit i izomerii nebo počet nábojů (odlišná migrace M + a M22+) • Nízké rozlišení IMS • V praxi často použita jako jedna z technik multidimenzionální analýzy, např. ve spojení s běžnou MS Aplikace • bezpečnost (výbušniny), vojenské aplikace (jednoduchá přenosná zařízení) • studium konformace proteinů a jiných látek v plynném stavu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 293 TOF-TOF (Medzihradszky, K. F.; Campbell, J. M.; Baldwin, M. A.; Falick, A. M.; Juhasz, P.; Vestal, M. L.; Burlingame, A. L. Anal. Chem. 2000, 72, 552). Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 29i 49 IM spektra lysozymu v závislosti na jeho konformaci ■JL f Leriidir lokítí ^comport 1 Clemmer D. E., Jarrold J. F. Mass Spectrom 1997, 32, 577592. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Figuro 11. Drift lima disiribuiicjiis ■ l>:::!.lJ for tha +6. +a and '10 charge slates of Ivsozyme thai wars el actio sprayed Irorr dbuHWe-intacI [toft] and d is u I fide-reduced [righi] solutions. The «-3 and +10 disulfide-intact ions were obtained by direct alecira-spray ionization. All other charge stales were obtained by proton i -I higher charge states with a base in the desolvation region. 295 Detekce iontů Faradayův pohár, Faradayova miska Elektronový násobič Channeltron Mikrokanálková destička (MCP) Indukce (FT-ICR-MS, orbitrap) "Daly" detektor Plošné multikanálové detektory (array detectors) Fotografická deska Kombinace MCP a diodového pole (MCP-diode array) aj... Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 298 Elektronový násobič dynody kolektor, 0 V • Obdoba fotonásobiče: konverzní elektroda se sérií dynod (klesající potenciál) a kolektorem. Elektronový násobič není zapouzdřen ve skleněné baňce. • Konverze iontu na elektron(y) na první elektrodě (např. Cu-Be). Znásobování elektronů na dynodách. Záchyt elektronů na kolektoru, vznik proudu. • Zisk ~ 106 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 -2 kV 300 50 8 Det< a detekční elektronika. Principy vakuové Spojení separace a hmotnostní spektrometrie: instrumentace (on-line, off-line, čipy) Mikrokanálková destička (microchannel plate. MCP) , 2 MCP s mikrokanálky Rozměry MCP • tloušťka ~1 mm • průměr 1 - 10 cm. Mikrokanálky • orientovány šikmo, • průměr ~ 3 - 20 mm. • Chevronová struktura v sestavách více MCP. -1 • pokryté polovodivou vrstvou PbO, ... vznik gradienu napětí podél mikrokanálku (kontinuální dynoda, násobení elektronů) Plošný detektor vhodný pro TOFMS Zisk jednoho MCP ~103, dvojitého MCP ~106. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G -2.2 kV Záznam dat v MS ionty 1 elektrony náboj, q konverze (konverzní účinnost, amplifikace) 1 I = q/t (t ... čas) proud 1 U = IR (R ... impedance) napětí ■ záznamové zařízení Odlišná schemata pro fotografickou desku a scintilační detektory Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 305 "Daly" detektor vyleštěná kovová elektroda, -30 kV tenký kovový film vrstvička fofosforu lont elektron(y) 4 fotony (fosfor) + Velmi nízký šum. + Velmi vysoký výkon (fotonásobič obvykle v režimu počítání fotonů). - Ruší světlo. - Vyžaduje nízké tlaky (p < 10-5 Pa). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Záznam dat v MS I(m/z) = f(X) = f(t) Skenující přístroje Skenovaná veličina MAG magnetický sektor B, U Q kvadrupólový filtr U, V, f IT, LT iontové pasti U, V, f Doba skenu ~ 1 s - 0.1 s ~ 1 s Přímý záznam v čase: TOF FT-ICR iontový cyklotron - 100 ms - 1 s Další neskenující přístroje mohou pužívat plošné detektory (array). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 306 fotonásobič 303 51 Záznamová zařízení digitální převodníky • A/D převodník (analog to digital) • T/D převodník (time to digital) fotografická deska (historický) zapisovač signálu (historický) analogový osciloskop s fotoaparátem (historický) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 308 Přesnost záznamu Přesnost (a správnost) měření dána počtem bitů AD převodníku Např. pro 8-bitový převodník 28 = 256 úrovní: nepřesnost odpovídá 1/2 úrovně min. rel. chyba > (2x(počet úrovní - = (1i2x255)-1 ~ 0.2 % počet bitů 1 8 12 16 24 počet úrovní 2 256 4 096 65 536 16 777 216 min. rel. chyba (%) 50 0.2 0.01 8x10-4 3x10-6 dyn.rozsah (rel. chyba < 10%) 50 800 13 000 3 000 000 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 311 52 Rychlost záznamu spektra ... dána vzorkovací frekvencí AD převodníku Faktory: doba skenu rozsah skenu požadované rozlišení požadovaná kvalita píku (počet bodů/pík) Př. 1: Požadavky na Q: doba skenu = 0.1 s, jednotkové rozlišení v rozsahu m/z = 200 - 2 000, >10 bodů/pík. Minimální vzorkovací frekvence? min. vzorkovací frekvence = (2 000-200)x10/0.1 = 180 ksample/s délka paměti = (2 000-200)x10 = 18 000 vz. ... pro 16-bitový převodník 36 kByte Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 313 Rychlost A/D převodníku Př. 2: Jak rychlý musí být A/D převodník pro TOFMS, abychom zaznamenali iont letící 20 ms s rozlišením 2 000, chceme-li definovat pík 10 body? Signál 100% 50% t = 20 ms, R = 2 000 R = míAm = t/(2At) At = tí2R = 20 ms/4000 = 5 ns (FWHM) celý pík (~10 bodů) ... 10 ns =i> tsampíe = 1 ns (1 nsívz) vzorkovací frekvence, f = 1í tsampíe = 1 Gsampleís Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 20 ms t T/D převodník (T/D converter, TDC) Počítání pulsů Náraz iontu na detektor puls zesilovač diskriminátor čítač T/D převodník (time to digital) 1 -bitový A/D převodník 2 úrovně: 0 a 1 Parametry: časové rozlišení (počet kanálů) aj. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 314 317 Vliv vzorkovací frekvence AD převodníku (TOFMS) 25000 - 25000 -2 Gsample/s H 1 Gsample/s 20000 500 Msample/s Iontový signál (a.u.) / l 20000 -i \ l\ 18000 -T i 16000 - n i T 15000 -/ \ 10000 -/ \ 1 /' \ 14000 -\ 12000 -^ 10000 -1 8000 - '1 \ 5000 - 1 \ ^ \ 5000 - J \ 6000 - / \ 10 ns 10 ns 4000 - 10 ns Time of flight ( ms) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 315 SA (V) 100 % Analogové spektrum (1 puls) prahová úroveň signálu 0 0 20 40 60 t (ms) 1 0 Digitalizované spektrum (1 puls) 0 20 40 60 t (ms) n ^ Akumulace n spekter 0 U L Akumulované digitalizované spektrum (n pulsů) 0 20 40 60 t (ms) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 318 53 T/D převodník (time/digital) Ze skupiny iontů dopadajících na detektor během jedné periody je využit pouze jeden. Vhodný pro záznam signálu s vysokou opakovací frekvencí přijatelná (statistika po naakumulování dostatečného počtu spekter). Nižší cena (oproti A/D). Aplikace: TOFMS s vysokou frekvencí extrakčních pulsů (>kHz) ESI - oTOFMS AP-MALDI - oTOFMS TOFMS s nízkým počtem iontů PD - TOFMS Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 319 L BS ;:: ... Wi ÍS !• 0 H * * ) f jiiv.: ■ m 95114 >nn: ve oa-ľocoani 1uJu.J.jL MS/MS J -u~i-J,i.U- 54 Základy vakuové techniky Evangelista Torricelli (1608-1647) Jednotka tlaku: 1 Torr = 1 mm Hg Tlak, p p = sílaiplocha [Pa, Nim2] 1 atm = 760 Torr = 101 325 Pa = 101.325 bar = 14.70 psi 1 Torr = 133 Pa Vakuum stav plynu s p < 101325 Pa Střední volná dráha molekuly Střední dráha, kterou urazí iont mezi 2 srážkami l(cm) = 0.66ip(Pa) ... pouze hrubý odhad pro vzduch při 25°C Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 325 Rychlost pumpování Rychlost pumpování, S S = Q [S] = Lis P MSkornof9 = MSpUmp9 + 1iCtof Správný návrh: Ctot > SpUmpa tj., nemá smysl koupit výkonnou pumpu a pak omezit celkovou rychlost pumpování komory úzkými spojovacími trubicemi. Pozn.: • V režimu molekulového toku pumpa nenasává plyn. Pumpa funguje jako past; molekuly, které dorazí k pumpě, se neodrazí zpět do komory. • Rychlost pumpování je různá pro různé plyny (klesá s m plynu). • Tlak v celém systému není stejný, záleží na umístění tlakového čidla. • Outgassing. Dobu nutnou k dosažení vakua prodlužuje přítomnost plynných a těkavých látek adsorbovaných (vzorek, otisky prstů) a absorbovaných v systému (plyny v těsnění, plastových součástkách). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 328 Režimy toku plynu 1. Turbulentní tok. (p > 10 kPa) velmi malá l mnoho srážek mezi molekulami 2. Viskózní, kontinuální tok. (p = 1000 - 0.1 Pa, "hrubé" vakuum) l = mm - cm: stále mnohem menší než rozměry vakuových aparatur více kolizí molekula - molekula než molekula - stěna 3. Molekulární tok. (p < 0.01 Pa, "vysoké" vakuum, HV, UHV) l > m: převládají kolize molekul se stěnami vakuové aparatury obvyklá situace v hmotnostním spektrometru pozn.: UHV = ultra high vacuum Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Vakuové pumpy Mechanická pumpa Difúzní pumpa Turbomolekulární pumpa Kryopast Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 329 326 Průtok plynu Průtok plynu, Q [Q] = Pa m3is, Pa Lis C ... konduktance trubice o průměru D a délce L C = f(D, L, p, plyn, T), [C] = Lis Při molekulárním toku C nezávisí na tlaku p: C oc D3iL (aproximace) Při viskózním toku C závisí na tlaku p: C o pD4iL (aproximace) Návrh vakuových aparatur • Krátké tlusté spoje =i> CT =í> rychlejší dosažení požadovaného tlaku. • Sériové spojení trubic - nejúzší místo omezuje celý systém: 1iCfof = S1iC, Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Mechanická pumpa 1 Jedno- a vícestupňové. Rotor v oleji - min. tlak omezen vypařováním oleje - nutná past na olejové páry - nutné výměny oleje 1 Tlak > 0.1 Pa ... "hrubé" vakuum. Rychlost pumpování, S: typicky 1 - 500 Lis Běžná pumpa v komerčních systémech. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 327 330 55 Turbomolekulární pumpa • Série velmi rychle rotujícich turbín (až 50 000 rpm). Molekuly plynu jsou odráženy lopatkami turbín. Obvodová rychlost turbíny > rychlost molekul plynu. • Závislost vstupního a výstupního tlaku na molekulové hmotnosti plynu: ln (Pou/Pin) °c • UHV pumpa, tlak > 10-8 Pa • Rychlosti pumpování do ~ 3000 L/s • Běžná UHV pumpa v komerčních systémech. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 331 Měření tlaku Hydrostatický tlakoměr • Stanovení tlaku z rozdílu hladin. • Rozsah do 1 kPa, u speciálních konstrukcí až do O.1 Pa. Mechanické tlakoměry • Stanovení tlaku podle výchylky pružné membrány. • Snímání vychýlky - mechanické - kapacitní (rozsah 1O5 - 10-2 Pa) Termočlánek (Thermocouple gauge) • Bimetalový termočlánek a odporově žhavené vlákno. • Přenos tepla z vlákna na termočlánek závisí na tlaku a druhu plynu. • Rozsah p: 100 Pa - O.1 Pa, u speciální varianty (convectron) 1OO kPa - 0.1 Pa. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 SS4 Difúzní pumpa • Speciální netěkavý olej se zahřívá topnou spirálou v základně, páry oleje stoupají trubicí uprostřed, tryskají šikmo dolů na chlazené stěny a stékají na základnu. Speciální olej letící z trysek strhává molekuly okolního plynu. • Často přídávána chlazená past (vodou, kapalným N2) nad pumpu -zachycení příp. úniku oleje. • UHV (ultra-high vacuum) pumpa, tlak > 10-6 Pa. • Spolehlivá pumpa, nevyžaduje údržbu. • Pomalý ohřev i chladnutí. Kryopast • Sorbent (např. dřevěné uhlí) chlazený na 4 K (kapalným He). • Nutnost regenerace. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 SS2 Měření tlaku Iontová trubice (Ion gauge) Bayard & Alpert: iontová trubice se žhavenou katodou. • Tři elektrody ve skleněné baňce: spirála (+), drát (-) ve středu spirály a žhavené vlákno (-) vně spirály (žhavná katoda). • Stejná sestava jako u otevřeného iontového zdroje: elektrony ze žhavého vlákna urychleny ke spirále, docházi k ionizaci plynu, záchytu iontů na drátu a měření proudu. p = ř(proud). Pozor, proud je funkcí složení plynu! • Rozsah p: 10-2 - 10-10 Pa (vysoké vakuum, UHV) Penning: iontová trubice se studenou katodou. • K tvorbě iontů je použit výboj. • Rozsah p: 1 - 10-4 Pa Pozn: v komerčních zařízeních se používají termočlánky a iontové trubice. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 335 Ohřev UHV systémů Molekuly plynu se adsorbují na vnitřní stěny hmotnostního spektrometru. Pomalá desorpce molekul plynu zvyšuje tlak a prodlužuje dobu nutnou k dosažení požadovaného vakua. Dosažení UHV je možné urychlit zahřátím systému (např. odporově vyhřívanou vodivou páskou omotanou kolem systému), což posune rovnováhu od adsorpci směrem k desorpci. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Spojení separace a hmotnostní spektrometrie Proč separace? ... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů, např. v případě proteomiky vzorek obsahuje běžně >102 peptidů Samotná MS a MS/MS není dostačující z několika důvodů: • vysoká pravděpodobnost výskytu 2 nebo více analytů o stejné m/z • překryv izotopických obálek analytů s blízkou m/z • vzájemné rušení analytů • omezený dynamický rozsah hmotnostního spektrometru • rozlišení 1. stupně při MS/MS často nedostatečné R ~ 500) • odstranění nečistot • zdroj dalších informací o analytech Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 SSS SS6 56 Typy interface Interface pro MALDI Plyn — vakuum Obvyklý postup: • tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle beam) • Nanesení kapalného vzorku na terčík • membránové interface • Vysušení vzorku • Vložení terčíku do spektrometru a analýza • kapilární kolona (klasická kolona + splitter) Režim Kapalina — vakuum 1. On-line • API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického tlaku) 2. Off-line • Průtokové sondy (FAB) 3. In-line • Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík) Přídavek MALDI matrice - pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku - přenos, 1. Smíchání s roztokem analytu (sheath flow, T, liquid junction) diferenciální pumpování - ionizace) 2. Nanesení roztoku na terčík pokrytý vrstvičkou matrice - Sběr frakcí Sběr eluentu 1. Diskrétní frakce 2. Spojitá stopa Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 338 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 341 Separace - ESI MS Interface pro MALDI Off-line Nejrozšířenější metody: Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip). Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky. 2D GE - MS Nanášení vzorku pomocí elektrospreje • 2-rozměrná gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu On-line Průtoková sonda s fritou • následné vyříznutí zóny a zpracování proteinu • běžná planární technika pro separaci proteinů Průtoková sonda bez frity Zmlžovač pro tvorbu aerosolu RPHPLC - ESI MS In-line Interface ROBIN • kapalinová chromatografie na reverzní fázi - ESI MS • běžná kolonová technika pro analýzu peptidů Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface Data dependent scan ... 1 MS sken následován několika MSÍMS skeny Off-line vs. on-line + Oddělení separace od hmotnostní analýzy (podrobněji v části o aplikacích) + Možnost archivování vzorku Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 339 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 342 57 Archivování vzorku (MALDI) Postup při separaci s MALDI MS a MS/MS detekcí 1. Nanesení eluentu na terčík 2. MALDI MS analýza (<10% vzorku spotřebováno) 3. Analýza MALDI MS dat 4. MALDI MS-MS vybraných píků (detailní analýza) (Po 1. kroku může být postup kdykoli přerušen.) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S4S Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line) Liquid —w —.....-v Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1143-1147. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S45 Nanášení vzorku ve vakuu (in-line i off-line) atmospheric pressure source chamber (p ~ 10-6 Torr) repeiier probe with capiiiary interface flange source coii rubber wheei Myiar tape repeller center (tape guide) propelled shaft Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 34S 58 Spojení čip - hmotnostní spektrometrie (čip, mikročip, microfluidic device) Proč mikro + makro? ... Možné výhody čipu: • integrace více kroků, "lab on a chip" (dávkování, příprava, separace ...) • paralelní analýzy (opakující se motiv na jednom čipu) • nízká cena - čip na jedno použití (při sériové výrobě) • veškeré úpravy na čipu, MS detektor Základní typy: 1.2D pole • afinitní pole: nejprve zakoncentrování specifických látek, poté MALDI MS přímo z čipu • pole vialek se špičkami pro ESI: zvýšení reprodukovatelnosti analýzy 2. Fluidní systém (čipy s kanálky) • systémy pro paralelní analýzu- pro ESI, MALDI ... • systémy integrující několik kroků Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 3Í 59 IV. Biologické aplikace MS Genom, proteom, metabolom. Malé organické molekuly - biomolekuly, léky, petrochemické produkty. Biopolymery (DNA, proteiny, cukry). Syntetické polymery. Proteomika Charakterizace peptidů a proteinů - proteinového komplementu genomu. V současnosti hlavní a nejperspektivnější aplikace hmotnostní spektrometrie. Genom o proteom. Uroveň exprese gen protein různá. Genom je v podstatě statický, proteom dynamický: exprese závisí na druhu a funkci proteinu, poloze v buňce, stavu a zdraví buňky. Funkce organismu souvisí bezpprostředně s proteomem. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 355 IUPAC názvosloví aminokyselin Triviální název Symboly Vzorec Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Ile Leu Lys Met Phe L K M F C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH Proline Pro P H Serine Ser S HO-CH2-CH(NH2)-COOH Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S5S Proteomika Analýza proteomu složitější než analýza genomu - více stavebních kamenů, aminokyselin - variabilita - modifikace aminokyselin - neexistuje metoda amplifikace proteinu obdobná PCR - nízká množství mnoha proteinů (např. regulačních proteinů) Diferenční proteomika Stanovení rozdílné exprese proteinů (přítonnosti nebo absence) v ovlivněném a zdravém organismu (orgán, tkáň, buňka). Funkční proteomika Stanovení všech interakcí (protein-protein, protein-DNA, atd.) v daném organismu (orgán, tkáň, buňka). Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S56 IUPAC názvosloví aminokyselin Trivíální název Symboly Vzorec Threonine Thr T CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH Tryptophan Tyrosine Valine Val V (C^CH-CH^^COOH Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S5Q IUPAC názvosloví aminokyselin Triviální název Symboly Vzorec Alanine Ala A CH3-CH(NH2)-COOH Arginine Arg R H2N-C(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)-COOH Asparagine Asn N H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH Aspartic acid Asp D HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH Cysteine Cys C HS-CH2-CH(NH2)-COOH Glutamine Gln Q H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH Glutamic acid Glu E HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH Glycine Gly G CH2(NH2)-COOH Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Historický přehled ionizačních metod vhodných pro analýzu peptidů a proteinů 1969 FD Desorpce polem (Beckey) 1974 PD Plazmová desorpce (McFarlane) 1976 SIMS MS sekundárních iontů (Benninghoven) 1981 FAB Ionizace rychlými atomy (Barber) 1984 ESI Electrosprej (Fenn) 1987 MALDI Laserová desorpce za účasti matrice (Karas, Hillenkamp) 1994 nano-ESI Nanoelektrosprej (Wilm, Mann) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 S60 Histidine His H S5T 60 Současné ionizační techniky v proteomice FAB max. m ~ 10 000 LD ~ 20 pmol (klasický FAB), < 1 pmol (CF-FAB) ESI max. m ~ 100 000 Da (z >> 1) LD < 10 fmol (rutinní) LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace) MALDI max. m ~ 106 (prakticky neomezen - TOF analyzátor) relativně nejvíce odolná vůči rušení nečistotami LD < 10 fmol (rutinní) LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 361 Gelová elektroforéza (GE) 2D SDS PAG E 2D: 2-rozměrná elektroforéza 1. rozměr: dle pl (izoelektrická fokusace) 2. rozměr: dle velikosti SDS pro denaturaci (náboj/velikost = konst.) PA: polyakrylamidový gel jako separační médium • Vhodná pro separaci tisíců až desetitisíců proteinů, v případě velmi jednoduchých směsí stačí i 1D GE • Rychlá identifikace a charakterizace proteinů na 2D gelu je nejběžnější analýzou současné proteomiky • Zhruba 5% proteinů a 30% peptidů migruje anomálně • PTM ovlivňují zdánlivou m proteinů (chyba až 50%) • Problematický transport proteinů z gelové matrice (elektroblot na membránu) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 364 Hmotnostní spektrometry v proteomice vysoký počet vzorkůÍčas TOF objasňění struktury QqTOF, IT, FT ICR Nová instrumentace MALDI TOF-TOF, MALDI LIFT TOF MALDI QqTOF • rychlá identifikace v MS modu • možnost detailní analýzy v MS-MS modu později Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 MALDI MS ESI MS-MS 362 Separační metody v proteomice GE gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu HPLC vysoceúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi IEC chromatografie na iontoměničích AC afinitní chromatografie CE kapilární elektroforéza Centrifugace běžná centrifugace, gradientová centrifugace Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 363 RP HPLC • Kolona: klasická, kapilární (f 300 mm) nebo nano LC (f 75 mm) • Náplň: C18, velikost nosiče: 3 - 10 mm (RP ... reverse phase) • Gradientová eluce, např: - start: 10% org fáze + 90% vodné fáze - konec: 80% org fáze + 20% vodné fáze - organická fáze: ACN (acetonitril) + 0.1% TFA (kyselina trifluoroctová) - vodná fáze: 0.1% TFA • Organický solvent přispívá k rozpustnosti peptidů, umožňuje detekci v UV (230 - 240 nm) a rychle se vypařuje, což je výhodné pro sběr frakcí např. pro MALDI MS. • Standardní technika kolonové separace pro peptidy a proteiny Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 366 61 Př.: RP HPLC směsi peptidů (digest BSA) Sample Tryptic Digest of BSA Mobile phase: A - 0,1% TFA in H20 E - 0.1 % TFA in ACIN Gradient: 10% to 50%B in 20 min IHow: LOmUmin Delector: UV @ 220nm 16-20 peaks 0 5 10 15 MIN Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Zdroj: ThermoFinnigan 2002 367 Enzymatické štěpení proteinů v 2D gelu 1. Wash the gel slices for at least 1 hr in 500 microliters of 100 mM ammonium bicarbonate. Discard the wash. 2. Add 150 microliters of 100 mM ammonium bicarbonate and 10 microliters of 45 mM DTT. Incubate at 60 degrees centigrade for 30 min. 3. Cool to room temp and add 10 microliters of 100 mM iodoacetamide and incubate for 30 min in the dark at room temperature. 4. Discard the solvent and wash the gel slice in 500 microliters of 50% acetonitrile/100 mM ammonium bicarbonate with shaking for 1 hr. Discardthe wash. Cut the gel into 2-3 pieces and transfer to a 200 microliter eppendorf style PCR tube. 5. Add 50 microliters of acetonitrile to shrink the gel pieces. After 10-15 min remove the solvent and dry the gel slices in a rotatory evaporator. 6. Re-swell the gel pieces with 10 microliters of 25 mM ammonium bicarbonate containing Promega modified trypsin (sequencing grade) at a concentration such that a substrate to enzyme ratio of 10:1 has been achieved. (If the amount of protein is not known, add 0.1-0.2 microgramsof modified trypsin in 10 microliters of 25 mM ammonium bicarbonate).After 10-15 minutes add 10-20 microliters of additional buffer to cover the gel pieces. Gel pieces need to stay wet during the digest. Incubate 4 hrs to overnight at 37 degrees Centigrade.Proceed to step 8 if further extraction of the gel is desired (recommended)-otherwise continue with step 7. 7. Approximately 0.5 microliters of the supernatant may be removed for MALDI analysis and/or the supernatant acidified by adding 10% TFA to a final concentration of 1% TFA for injection onto a narrow-or microbore reverse phase column. (If necessary the sample's volume may be reduced~1/3 on a rotatory evaporator.) 8. Extraction (Optional)- Save supernatant from step 7 in tube X, and extract peptides from gel twice with 50 microliters of 60%acetonitrile/0.1% TFA for 20 min. Combine all extracts in tube X (using the same pipet tip to minimize losses), and speed vac to near dryness.Reconstitute in 20 microliters of appropriate solvent. Proceed with chromatography or MALDI analysis. Zdroj: http://www.abrf.org/ResearchGroups/ProteinIdentification/EPosters/pirgprotocol.html Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 370 Enzymatické štěpení proteinů enzym protein---» směs peptidů Důvody přechodu z oblasti vysokých m/z do oblasti nízkých m/z: 1. Lepší parametry hmotnostních spektrometrů (vyšší rozlišení, přesnost a správnost stanovení m/z, citlivost) 2. Úžší izotopová obálka (jednodušší spektra, vyšší citlivost) Pozn.: digestion = enzymatické štěpení, trávení digest = směs tryptických fragmentů, produkt enzymatického štěpení úpravy před štěpením: • redukce -S-S- můstků: dithiothreitol (DTT) • alkylace -SH: jodoacetamid (IAA) =i> m: + 57 Da • důvod: „rozbalení proteinu" ... lepší přístup enzymu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 368 Strategie analýzy v proteomice Základní typy analýzy 1. Identifikace (potvrzení přítomnosti známého proteinu ve vzorku) 2. Relativní kvantifikace v diferenciální proteomice 3. Sekvenace neznámého proteinu/peptidu (de novo sequencing) Vzorek je obvykle směs mnoha proteinů/peptidů 4 4 4 4 4 4 Analýza založena na použití separací s MS a MS/MS detekcí Identifikace Sekvence mnoha proteinů již byla popsána a není nutné ji znovu analyzovat. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 371 Enzymatické štěpení proteinů Nejčastěji trypsin (různě upravený, např. TPCK k potlačení chymotrypsinové aktivity, methylací aj.). Další enzymy: lysin, chymotrypsin, CNBr aj. Produkty enzymatického štěpení • specifické fragmenty analyzovaného proteinu Např. trypsin štěpí na C-straně aminokyselin K or R, pokud není soused P. (Skutečná pravidla ještě složitější): N terminál-X-X-X-X-X-K-Y-Y-Y-Y-Y-Y-C terminál (Y*P) • nespecifické fragmenty analyzovaného proteinu • artefakty (modifikace aminokyselin, např. oxidací, díky PA gelu atd.) • fragmenty enzymu (autolýza) • fragmenty keratinu ( ) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 369 Strategie analýzy v proteomice Top-down • izolace proteinů • zpracování proteinů, enzymatické štěpení • analýza peptidů (MS, MS/MS) Bottom-up • enzymatické štěpení • separace peptidů • analýza peptidů (MS, MS/MS) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 372 62 Některé užitečné termíny genotyp genetické vybavení organismu, dispozice fenotyp skutečný obraz organismu, výsledek interakce s prostředím in vivo v žijícím organismu in vitro mimo žijící organismus, v umělém prostředí http://www.meta-library.net/gengloss Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 373 Identifikace proteinu Známé informace: - Původ vzorku (organismus) - Izoelektrický bod (pI) z 2D PAGE) - Molekulární hmotnost proteinu z 2D PAGE, příp. MALDI TOF MS - N- a C- část sekvence (Edmanova degradace) ... Tyto informace nejsou dostatečné k identifikaci proteinu (nebo je jejich získání nemožné, příp. zdlouhavé) Metody identifikace A. 2D GE + X + MS (peptidové mapování) B. 2D GE + X + RPHPLC + MS a MS/MS (sequence tag, AMT) C. X + 2D LC (např. IEC a RHPLC) + MS a MS/MS D. X + AC (afinitní chromatografie) + MS a MS/MS (IMAC, ICAT) E. Strategie využívající X a izotopové reagenty/standardy X ... selektivní enzymatické štěpení Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 374 PMF S. MS analýza a vyhodnocení výsledků MALDI MS ESI MS llllllhlll hledání v proteinové databázi (identifikace známých proteinů) peptidové fragmenty (digest proteinu) \ separace - ESI MS 4u ESI MS-MS vybraných peptidů struktura (nové peptidy a proteiny) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 377 Identifikace proteinu • Získání specifických informací o proteinu pomocí MS • Srovnání specifických vlastností analyzovaného proteinu s knihovnou (obsahující specifické vlastnosti) známých proteinů. Specificita: 1. Analýza více peptidů se vztahem k proteinu peptidové mapování (PMF, peptide mapping), získání peptidového fingerprintu, analýza m/z produktů enzymatického štěpění 2. Podrobná analýza jednoho peptidu z proteinu a) sequence tag, MS-tag - analýza části sekvence (z fragmenatce peptidu v plynné fázi b) accurate mass tag, AMT - analýza složení části proteinu (z přesné m produktu enzymatického štěpění,) • Vyžaduje vysokou správnost MS analýzy + kvalitní databázi • Identifikace používající MS jsou výrazně rychlejší a citlivější než chemické metody (Edmanova degradace) • Negativní výsledek hledání v databázi = nový protein !!!!! Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 375 Příklad hledání v databázích: MS Fit Zadání: Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 378 63 Příklad hledání v databázích: MS Fit Výsledky: MS Fit - Identifikace proteinu z hmotností peptidových fragmentů pomocí programu na http://prospector.ucsf.edU/ucsfhtml3.2/msfit.htm Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Metoda Sequence-Tag (MS-Tag) Identifikace proteinu na základě přesné znalosti malé části jeho sekvence (sequence-tag, MS-tag), zpravidla sekvence jednoho peptidu Přesné stanovení sekvence aminokyselin části proteinu (typicky jednoho peptidového fragmentu z enz. štěpení) - obvykle pomocí ESI-MS/MS nebo MALDI-PSD-MS přímo z tabulky píků nebo spektra Potřebná délka části sekvence cca. 8-10 aminokyselin Čím delší sekvence je známa, tím přesnější je identifikace proteinu Známá část sekvence je hledána v proteinových databázích Další informace o proteinu: druh organismu, m (2D GE), pl atd. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 S79 SS2 Nedostatky PMF Vyžaduje izolaci čistého proteinu, max. 2-3 proteiny před enz. štěpením Vyžaduje správnost stanoveni m/z < 100 ppm, mnohem lépe <10 ppm Vyšší správnost stanovení míz => jednoznačnější odpověď hledání v databázi Nepřítomnost očekávaných peptidů v digestu obvykle menší problém než přítomnost nadbytečných peptidů Zpravidla 4-5 peptidů dostačujících k získání spolehlivého výsledku Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Strategie MALDI MS a LC - ESI MS peptidové mapování MS/MS: MS-tag Hmotnostní spektrometrie biomolekul2010 Zdroj: ThermoFinnigan 2002 SSS 380 PMF: teorie vs. praxe Nadbytečné píky • neselektivní štěpení (např. chymotryptická aktivitá trypsinu) • nečistoty (např. keratiny) • nedostatečná separace (další proteiny ve skvrně) • autolýza enzymu • post-translační modifikace (PTM), artefakty Chybějící píky • špatně rozpustné peptidy • adsorpce peptidů • vzájemné rušení peptidů • neselektivní rozštěpení peptidu • nedostatečné štěpení proteinu (sterické zábrany) • PTM, artefakty Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 381 Schema 2D LC/MS/MS Hmotnostní spektrometrie biomolekul2010 Zdroj: ThermoFinnigan 2002 384 64 Řízení 2D LC/MS/MS experimentu Hmotnostní spektrometrie biomohkul2010 Zdroj: ThermoFinnigan 2002 387 Accurate mass tag (AM T) • Identifikace proteinu na základě znalosti správné hmotnosti jednoho fragmentu po enzymatickém štepení • Správné stanovení hmotnosti proteinu (typicky jednoho peptidového fragmentu z enz. štěpení) - stanovení m pomocí FT ICR MS atom 1H 12C 14N 16Q 32S m [Da] 1.007825 12.000000 14.003074 15.994915 31.972071 • Typický počet aminokyselin v řetězci peptidu ~ 10. Přesná hmotnost aminokyselin - např. mmo„o(G)=57.02146, mmono(A)=71.03711 atd. • Při správnosti stanovení m/z < 1 ppm je vysoká pravděpodobnost, že dané hmotnosti peptidu odpovídá jediné složení aminokyselin - viz. následující obr. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 390 65 AMT ■g "S. Q. A U, g R = ltP lllliAAiAA K - I .iiiílilli. li_All_tli_ MS směsi všech možných 10-merů peptidů při různých hodnotách R (a správnosti stanovení m/z): 103 (1000 ppm) (A), 104 (100 ppm) (B), 105 (10 ppm) (C), and 107 (0.1 ppm) (D). Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolič and R. D. Smith Anal Chem. 2000, 72, 3349-3354 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 3 >o O Q. AMT . 11130 Mass Measurement Accuracy (ppm) Figure 2. Number of 10-mer polypeptides at mass 1178-4 Da that can be distinguished as a function of mass measurement accuracy. As mass measurement accuracy improves beyond 100 ppm (—01 Da) the number of distinguishable polypeptides increases significantly. Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolič and R. D. Smith Anal Chem. 2000, 72, 3349-3354 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 392 10 Aplikace: proteiny a peptidy. Izotopové značení. Metoda K Stanovení sekvence. Post-translační modifikace. Některé zkratky v proteomice GIST Global Internal Standard Technology (2H, 13C, 15N) ICAT Isotope-Coded Affinity Tags (cystein) PhIAT Phosphoprotein Istope-coded Afinity Tag (fosforylované peptidy) IMAC Ion Metal Afinity Chromatography (afinitní záchyt fosfopeptidů) AQUA Absolute QUAntification (pomocí uměle syntetizovaných izotopicky značených peptidů jako interních standardů) Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture (růst kultrury v normálním a obohaceném médiu) Multidimensional Protein Identification Technology (SCX - RHPLC - MS/MS) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 396 66 Analýza ICAT (isotope-coded affinity tags) ICAT ... isotope-coded affinity tags (R. Aerbersold) rozdíly v expresi proteinů stanovením relativních intenzit peptidů 1. Frakcionace proteinu 2. Enzymatické štěpení celého vzorku 3. Izotopové značení (ICAT) 4. Smíchání a MS analýza Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 397 Analýza ICAT Healthy Quantitation and Credit: Dr. Ruedi Aebersoid protein identification Institute for Systems Biology, Seattle, WA Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 398 Stanovení sekvence proteinu/peptidu Klasická analýza - Edmanovo odbourávání - Určení koncových skupin (N, C) Nedostatky: doba analýzy, relativně nízká citlivost Současná strategie: kombinace více metod - preparativní separace - enzymatické štěpení - MS - MSiMS, ISF, PSD - MSn Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 401 Analýza ICAT Pozn. • Proteiny lze označit před enzymatickým štěpením (záměna kroku 2 a 3) Nedostatky ICAT první generace • Rozdíl m izotopových značek roven 8 =i> občas interference v MSiMS spektrech • Nepatrně odlišná retence analytu označkovaných lehkou a těžkou formou značky. Důsledek: poměr lehké a těžké formy nelze zjistit z poměru iontových intenzit během HPLC MSiMS; je třeba integrovat celý LC pík ICAT druhé generace • Použití 9 atomů 13C ve spojovacím řetězci (místo 8 atomů D) • Stejný eluční čas lehké i těžké formy v HPLC Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 399 Stanovení sekvence peptidu MS Kombinace chemického štěpení a MS 1. Tvorba směsi peptidových fragmentů lišících se o jednu aminokyselinu chemickou cestou: a) fenyl izothiokyanát + A1A2A3.. fenylizothiohydantoinA2A3.. + A1 fenyl izothiokyanát + A2A3.. fenylizothiohydantoinA3.. + A2 atd. fenylizokyanát v malém množství jako terminační činidlo tvoří malou frakci fenylkarbamátu od každého peptidu b) alternativní strategie je založena na použití karboxypeptidázy po různě dlouhou dobu nebo v různých množstvích =i> vznik několika směsí peptidů 2. MALDI MS směsi fragmentů peptidů. • aminokyselina je určena ze vzdálenosti sousedních píků, sekvence aminokyselin z pořadí píků Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 402 67 Patterson, D. H., Tarr, G. E., Regnier, F. E. and Martin, S. A., Anal. Chem.1995, 67, S971. Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 403 Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů. x S yS zS x 2 y 2 z2 x 1 y1 z1 H+ R1 O 11 R2 O O H 2N - CH - II C - NH - 1 CH - C - NH - CH - C - NH - a1 ~1 c1 a2 b2 c2 aS R4 CH - COOH immoniové ionty aminokyselin: R + I H,N = C 2 I H Roepstorff & Fohlman, Biomed. MS 1984, 11, 601. Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 406 Stanovení sekvence peptidu MS/MS CID • nízkoenergetická CID je v souč. nejrozšířenější metoda fragmentace • IT, TQ, QTOF ISD • vyžaduje izolaci čisté látky • MALDI TOF PSD • horší kvalita spekter než z CID, často nutno spojovat spektrum z více částí • MALDI TOF Pozn. • vysokoenergetická CID, SID, fotodisociace, disociace po nárazu elektronu nejsou používány rutinně • Leu/Ile ... izomery, Gln/Lys ... izobary Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 404 Fragmentace peptidů Fragmentace 1 nebo 2 vazeb peptidového řetězce - fragmenty obsahující N terminál (a, b, c) - fragmenty obsahující C terminál (x, y, z) - tyto ionty mohou vzniknout i fragmentací 2 vazeb řetězce - ztráta NHS, H2O, CO2 Fragmentace bočního řetězce (zbytku aminokyseliny) - obvykle ztráta části bočního řetězce aminokyseliny - fragmetny typu d, w, v Vnitřní fragmenty - neobsahují N ani C terminál ... menší analytický význam Immoniové ionty - užitečná informace o aminokyselinách; m(IM)= m(AKres) - 27 Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů. Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 405 408 68 Další fragmenty peptidů "h* r1 0 chr1 ■ 0 r4 1 ii ii , ,„, ii h,n —c —c-n —c hn = c —c —n ill II -c-cooh III II h h h h h (t v2 h chr' 0 r4 h+ ii ii 1 c-c-n-c-cooh 1 1 1 1 1 1 h h h Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 4Q9 CID fragmentace Typy iontů v CID 1. série píků iontů b a y 2. doprovodné píky -17, ztráta NH3 z Gln, Lys, Arg -18, ztráta H2O ze Ser, Thr, Asp, Glu a (tj. b - 28), satelitní série fragmentů typu b (ztráta CO) 3. immoniové ionty aminokyselin. 4. interní fragmenty - zejm. od Pro ve směru C konce Výběr prekurzoru v CID MS/MS: z = 2: [M+2H]2+ Iont s dvěma náboji poskytuje CID spektra vyšší kvality než při z = 1 a 3 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 412 aminokyselina m (mono) m (immonium) m (doprovodné ionty) A 71.03712 44 m reziduum m ... reziduum R 156.10112 129 59,70, ?3,B7,100,112 N 114.04293 8? D 115.02695 88 ?Q C 103.00919 ?6 E 129.04260 1Q2 Q 12B.05B5B 101 56,B4,129 G 57.02147 30 H 137.05B91 110 82,121,123,138,166 I 113.0B407 86 44, ?2 L 113.0B407 86 44, ?2 K 12B.09497 1Q1 ?Q,B4,112,129 M 131.04049 1Q4 61 F 147.06B42 120 91 P 97.05277 70 S B7.03203 60 T 101.0476B 74 W 1B6.07932 159 77,117,130,132,170,171 Y 163.06333 136 91,1Q? V 99.06B42 72 41,55,69 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 41Q ISD fragmenty Pravidla fragmentace ... dle relativní pevnosti vazeb. Typické produkty fragmentace peptidů: c, y, z x 3 y3 z3 x 2 y2 z2 a1 b1 R1 O II R2 O R3 O H H 2N - CH - C - NH - CH - C - NH - 1 CH - 1 C - NH - ^2 x 1 _y1_ )l'z1_ H+ R4 CH - COOH a2 b2 c2 a3 b3 c3 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 413 Výpočet molekulové hmotnosti peptidu/proteinu Suma hmotností reziduí aminokyselin + Hmotnost koncových skupin: obvykle 1 Da (H) pro N konec (-NH2) a 17 Da (OH) pro C konec (-COOH) + Hmotnost protonu 1 Da - iont většinou ve formě [M+H]+ (ale i 23 Da pro adukt [M+Na]+ atd.) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 ISD. Analyt: 20 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N2. (V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410 -4416, 1998.) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 414 411 69 PSD fragmenty Typické produkty fragmentace peptidů: a, b, y, z, d. Doprovodné píky -17 (ztráta NH3) a -18 (ztráta H2O). Immoniové ionty aminokyselin. Interní ionty - zejm. od Pro ve směru C konce (B. Spengler J. Mass Spectrom. 32, 1019-1036, 1997) Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 416 immoniové ionty aminokyselin: Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G Další typy disociace Electron capture dissociation. ECD Zubarev, R. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Electron Capture Dissociation of Multiply Charged Protein Cations - a Nonergodic Process J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3265-3266. McLafferty, F. W.; Turecek, F. Interpretation of Mass Spectra; Fourth ed.; University Science Books: Mill Valley, CA, 1993. Poskytuje odlišné, často komplementární fragmenty ve srovnání s CID a PSD Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2G1G 417 420 70 Vyhodnocení MS/MS spekter peptidů Manuální a semiautomatická dedukce sekvence • lokalizace iontových sérií typu b a y (doprovodná série a) • identifikace immoniových iontů • identifikace vnitřních fragmentů • interpretace komplikována výskytem dalších fragmentů • ne každý peptid po štěpení trypsinem ma má R a K na C-konci (nespecif.) ... stanovení sekvence neznámého peptidu z CID je často nemožné Automatické stanovení sekvence • MS/MS spektrum neznámého peptidu porovnáno s databází počítačem vygenerovaných spekter všech možných peptidů, které mají hmotnost prekurzoru • algoritmus Sequest (J. R. Yates III et. al., 1994) ... mnohem úspěšnější než deduktivní přístup Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 421 Sekvenování proteinu Př.: využití různě dlouhé doby štěpení se značením terminálu. Zjištění terminálu: hydrolýza v H218O (C-terminál nebude označen) Pozn.: výměnná reakce však může probíhat i na C terminálu —g '——a ST;::- HK Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 424 Pomocné metody při sekvenování Hydrolýza proteinu v H218O zjištění terminálu: C-terminál nebude označen Hydrolýza proteinu ve směsi H218O a H216O (1:1) 1. MS: dublety tryptických štěpů (vyjma fragmentů s C-koncem proteinu) 2. MS/MS: oba dubletové píky peptidu vybrány jako prekurzor pro MS/MS; pouze štěpy obsahující C konec peptidu budou ve formě dubletu ... přehlednější spektra Esterifikace (methylace) karboxylových skupin peptidu Am = +14 / karboxylovou skupinu (-COOH -COOCH3) porovnání spekter původního a methylovaného peptidu obdobná technika založena na derivatizaci aminoskupin peptidu Pozn. 1: výměnná reakce však může probíhat i na C terminálu Pozn. 2: vznikají složitější izotopové paterny s hmotnostmi M (2x16O), M+2 (1x16O,1x 2x18O) a M+4 (2x18O). Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 423 Post-translační modifikace (PTM) modifikace po přenosu RNA protein uskutečněném na ribozomu nedají se objasnit na základě znalosti genomu souvisejí významně s funkcí proteinu popsáno více než 200 typů PTM (databáze Delta Mass) často pouze malá část proteinu modifikována =i> citlivost vyžaduje selektivní izolaci peptidů s modifikovanou aminokyselinou vazba mezi peptidem a mod. skupinou často slabá Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 426 71 Post-translační modifikace (PTM) Běžné PTM: • fosforylace • glykosylace • acylace (acyly mastných kyselin, acetyl) • připojení glykosylfosfatidyl inositolu • produkty proteolýzy • karboxylace (kyseliny glutamové) • deamidace asparaginu a glutaminu Některé modifikace mohou být značně složité, např. oligosacharidové modifikace glykoproteinů (mnoho druhů cukrů a mnoho míst proteinu, na která se cukry mohou navazovat - O, N). K objasnění slouží kombinované metody používající MSn a enzymatické štěpení (N-glykosidáza, O-glykanáza atd. ). Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 Gln I GlnI Thr I Glu I b2 b b4 b5 be Asp I Leu I Gln I Asp I Lys MH2 2+-H3PO4 MH2 / Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 427 430 Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 Gln I GlnI Thr I Glu I Asp I Leu I Gln I Asp I Lys Zdroje informací: 1. Molekulární píky MH22+ a (M - H3PO4)H22+, rozdíl Am = 98 (Am/z = 49) 2. b-ionty: Am/z ^3^)= 167 3. y-ionty: Am/z (yM-yi3)= 167 (kredit: K. R. Jennings) Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 43i Fosforylace Postup při identifikaci: 1. Příprava proteolytické směsi peptidů (obsahující fosfopeptidy) 2. Oddělení fosfopeptidů např. HPLC, CE, afinitní chromatografií, např. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), viz. Porath, J. Protein Expression Purif. 1992, 3, 26S. S. MS/MS analýza fosfopeptidů Relativně stabilní monoesterická vazba => posun píků v MS/MS spektrech (Am = + 80 Da) aminokyselina serin 87 threonin 107 tyrosin 16S M (zbytek) M (monoester H3PO4) 167 187 24S Hmotnostní spektrometrie biomoIekuI 2010 429 Analýza S-S můstků. Proteiny. MS databáze. Aplikace: DNA, sacharidy, syntetické polymery. Analýza disulfidových můstků cystein (-SH) — cystin (-S-S-), intra- a inter- molekulární můstky Počet cysteinů - pomocí alkylace cysteinu • např. alkylace jednoho cysteinu vinylpyridinem zvýší hmotnost proteinu o 105 Da => počet cysteinů = Am/105 Lokalizace cysteinů v proteinovém řetězci Enzymatické štěpení a rozdělení digestu na 2 alikvoty: 1. alikvot ... MS analýza 2. alikvot ... redukce -S-S- (např. dithioerythritolem) a následná MS analýza Porovnání 2. spektra s 1. spektrem: 1. Am = 2 Da => peptid s intramolekulární -S-S- vazbou 2. první pík zmizí, dva další s nižší m/z se objeví => intermolekulární můstek mezi 2 peptidy Znalost sekvence aminokyselin (MS-MS) umožní přesnou lokalizaci -S-S-můstků v proteinovém řetězci. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 433 Vliv S-S můstků při ESI-MS Struktury lysozymu (p-sheet a a-helix) stabilizovány 4 S-S můstky Redukce 1,4-dithiothreitolem (DTT) odstraní S-S můstky „Unfolded" protein s více obnaženými bazickými rezidui aminokyselin Vyšší počet nábojů iontu Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 1200 1500 1800 HK 434 Nekovalentní interakce • Interakce s nízkomolekulárními ligandy (+ionty kovů), jinými proteiny, oligomery atd. • Není vždy jasný vztah mezi výskytem komplexu v (g) a (l) • Komplexy disociují během ionizace a MS analýzy Př. 1. Komplexy hovězího hemoglobinu se stabilizují ve formě tetrameru vazbami (cross-linking) s glutaraldehydem (přemostění mezi lysylovými rezidui). Poté MALDI MS (viz obr. dále) 2. ESI pro komplexy proteinu s ligandy (např. metaloproteiny s léky) díky šetrné ionizaci, která sotva stačí k odstranění vody. Obtížnější je výzkum interakce mezi 2 proteiny - použití měkkých extrakčních podmínek, příhodných podmínek pro tvorbu komplexů v roztoku Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 u u 437 73 Vědecké databáze na internetu Uvedené databáze jsou pouze příklady, ne plný výčet. NCBI (National Center for Biotechnology Information) database Medline: www.ncbi.nlm.nih.gov Scirus: www.scirus.com ScienceDirect: www.sciencedirect.com Databáze pro organickou chemii NIST Chemistry WebBook (NIST) Spectra Online (ThermoGalactic) Spectral Data Base System, SDBS (NI AIST) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 Další pomůcky na internetu Pomůcky MS-Comp - návrh možných kombinací aminokyselin, tabulka hmot dipeptidů MS BLAST 2 - krátké sekvence (6 aminokyselin) BLAST a FASTA - proteinové homology GlycoSuite DB, GlycoSciences - analýza sacharidů Další programy Kalkulátory hmotností (GPMaw, SHERPA, PAWS, MW Calculator) aj. Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 439 442 Vědecké databáze na internetu Internetové zdroje pro identifikaci proteinů pomocí MS metod • Eidgenossische Technische Hochschule (MassSearch) www.cbra.inf.ethz.ch • European Molecular Biology Laboratory (PeptideSearch) www.mann.emblheidelberg.de • Swiss Institute of Bioinformatics (ExPASy) www.expasy.ch/tools • Matrix Science (Mascot) www.matrixscience.com • Rockefeller University (PepFrag, ProFound) prowl.rockefeller.edu • Human Genome Research Center (MOWSE) www.seqnet.dl.ac.uk • University of California (MS-Tag, MS-Fit, MS-Seq) prospector.ucsf.edu • Institute for Systems Biology (COMET) www.systemsbiology.org • University of Washington (SEQUEST) thompson.mbt.washington.edu/sequest Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 440 MS nukleových kyselin a oligonukleotidů • Ionizace: obvykle vyšší výtěžek negativních iontů. Analýza typicky v negativním módu. • Ionizační technika: MALDI (obvykle IR MALDI) • Méně úspěšná než v případě proteinů a peptidů • Vyšší stupeň fragmentace a více aduktů • Důkladné odsolení . prevence tvorby četných aduktů se sodíkem. • MALDI těžkých DNA (>100 kDa): lineární přístroj, IR laser, pulsní extrakce Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 443 Vědecké databáze na internetu Další odkazy: UMIST (pepMAPPER) wolf.bms.umist.ac.uk/mapper European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg (PeptideSearch) www.narrador.embl-heidelberg.de Scripps, ThermoFinnigan (Sequest) fields.scripps.edu/sequest/ Proteometrics (MS/MS Sonar) www.proteometrics.com Proteinové (peptidové) databáze Genpept - NCBI GenBank NBRF - National Biomedical Research Foundation Swissprot - Swiss Institute of Bioinformatics Owl - Leeds Molecular Biology Database Group Delta Mass - databáze posttranslačních modifikací proteinů Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 441 MALDI MS nuklevých kyselin a oligonukleotidů Typické matrice 3-hydroxypikolinová kyselina 2',4',6'-trihydroxyacetofenon pikolinová kyselina Typické aplikace • charakterizace syntetických a biologických oligonukleotidů (stanovení m) • analýza produktů PCR, analýza mutací (záměna bazí) • DNA sekvenování - Sangerovo sekvenování (klasická metoda) - Sekvenování pomocí exonukleázy - Fragmentace (v plynné fázi) Hmotnostní spektrometrie biomoiekui 2010 444 74 MS nuklevých kyselin a oligonukleotidů • MALDI MS spektra velmi těžkých NA (>2 tisíce nukleotidů) • správnost určení m < 1% ... nejlepší ze současných metod • výborná citlivost metody: < 1 fmol Berkenkamp, S; Kirpekar, F; Hillenkamp, F Science 1998, 28í, 260-262. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi Schéma fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi a značení fragmentů w3 x3 y3 z3 w2 w2 x2 y2 wi xi yi zi No ai bi c to— a2 b2 c2 a3 b3 c3 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Bi B2 B3 B4 O O O HO p —— o P —— O OH OH OH OH di d2 d3 445 44S IR MALDI MS ribonukleové kyseliny ma- RNA 104jner (transcript) Ě í 75" (M-H)- z I Š 50- A < (M-2H)2 /1 | 25- I ,1 10000 2Q0OO 40P00 60P00 I HK m/z Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 446 Analýza sacharidů Měkké ionizační metody: MALDI, ESI. MSn pro stanovení sekvence a struktury Použití enzymů k částečnému štěpení sacharidů před MS analýzou Běžné monosacharidy: glukóza, manóza, galaktóza, fukóza, N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin a N-acetylneuraminová kyselina (sialic acid). Stanovení úplné struktury oligosacharidů je obtížnější než u proteinů a nukleových kyselin důsledek izomerické povahy stavebních kamenů a jejich možného větvení. k objasnění struktury nestačí jen znalost stavebních jednotek a jejich pořadí, ale též způsob větvení, poloha větve a optická konfigurace každé glykosidické vazby Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 449 Sekvenování NA pomocí exonukleázy a MALDI MS [M-HJ {WI-2HY uáltr (JUM am in.y m/r 7000 '■MU Figure 4. DE MALDI mass spectrum of a crude synthetic DNA 31-mer (M = 9486.2 calculated). Mass measurements on the failure products define the sequence up the 3' trinucleotide (see Table 1). Asterisks indicate i 80-Da satellite peaks: instrument. 1.3 m linear; matrix. 3-HPA. Zdroj: Juhasz, P.; Roskey, M. T.; Smirnov, I. P.; Haff, L. A.; Vestal, M. L; Martin, S. A.; Anal. Chem.; 1996; 68(6); 941-946 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Nomenklatura MS/MS oligosacharidů Nomenklatura MS fragmenty s nábojem na neredukující straně: A, B a C; fragmenty s nábojem na redukující straně X, Y a Z podle toho zda štěpí hruh nebo glykosidickou vazbu. Spodní index u fragmentů B, C, Y a Z iontů udává počet rozštěpených glycosidických vazeb, horní levý index u fragmentů A a X udává vazby, které byly rozštěpeny. Spodní indexy a, b atd. udávají štěpenou větev u větvených sacharidů. Fragmenty B, C, Y a Z spolu s rozdílem hmotností lze použít k určení sekvence a větvení. MS umožňuje určení optické izomerie glykosidické vazby. Metoda je založena na selektivní oxidaci CrC^ p-anomeru derivatizovaných hexóz za vziku ketoesteru. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 447 450 75 a) MS2 of 1497.8. [M+Na]* > v. MSn oligosacharidů i CH£)R " -Ar Ion fragments produced upon (a) MS 2 , (b) MS 3 and (c) MS 4 of permethylated maltoheptaose. GlCßl— 4GlCß1—4GICß1-4QIC&1—4G!cß1—4Gleß1—4GIC Maltoheptaose Zdroj: Weiskopf, A. S.; Vouros, P. and Harvey, D. J. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1493-1504. Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 MSn oligosacharidů Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 451 454 76 Lipidy Mastné kyseliny, acylglyceroly, deriváty cholesterolu, fosfolipidy a glykolipidy FAB, DCI (desorpční chemická ionizace) MALDI Negativní mód ([M-H]- ionty) Fragmentace fosfolipidový anion fragmenty sacharidů Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 Další témata (pro zájemce; ne ke zkouškám) Fragmentace - chemie reakcí v plynném skupenství Izotopové zředěnííobohacení, kvantifikace v MS Preparativní MS, historie: příprava 235U Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 457 460 Analýza syntetických polymerů MALDI TOFMS vysoká MmaX, jednoduchá spektra, počet nábojů z = 1 alternativa GPC Analýza Stavební jednotka (monomer) Koncové skupiny Absolutní molekulová hmotnost Polydisperzita (střední m, rozptyl m) Komplikace Tvorba aduktů s Na+, K+ Hmotnostní diskriminace ... ionizační i detekční účinnosti = f(m) Správná transformace z časové do hmotnostní domény Příklad: Carman Jr, H.; Kilgore, D.; Eastman Chemical Company, USA, ASMS 1998 Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 458 v.v.m-i Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 V. Otázky & konzultace Jan Preisler Ústav chemie, Komenského nám. 2, kancelář č. 148 tel.: 54949 6629, preisler@chemi.muni.cz Aktualizovaný studijní materiál ke stažení ve formátu pdf: http://bart.chemi.muni.cz/courses/ Další konzultace v mé kanceláři. Termíny zkoušek Prosinec? Leden. Únor? Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 ^-o O) co o 459 462 77 Otázky 19. Na grafu počtu peptidů vs. správnost měření m/z (metoda AMT, obr. 301) vysvětlete přítomnost plata mezi 200 a 700 ppm. 20. Srovnejte výhody a nevýhody 2DGE a kolonových separačních technik v proetomice. 21. Které parametry hmotnostního spektra se mohou zlepšit, budeme-li zaznamenávat signál z a) FT ICR MS, b) TOF MS, c) IT déle? 22. Proč je v hmotnostním spektrometru vakuum? 23. Co je nejvýznamnějším omezením rozlišení v MALDI TOF MS? Vysvětlete princip technik vedoucích k vyššímu rozlišení MALDI TOF MS. 24. Jaký je rozdíl mezi jednotkami u, Da a Th? 25. Jaký je rozdíl mezi energetickou a rychlostní disperzí iontů? 26. Ve které části TOFMS se tvoří analyticky významné fragmenty během a) MALDI ISD, b) MALDI PSD? Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 466 Otázky 7. Proč je výhodné použít při měření izotopového poměru daného prvku přístroj, který stanovuje oba izotopy zároveň? 8. Lze použít kvadrupólový filtr ke stanovení proteinu o hmotnosti 30 000 Da? 9. Jakou ionizační metodu a jaký hmotnostní spektrometr navrhujete použít k: a) detekci výbušnin na letišti b) sekvenování malých peptidů c) semikvantitativnímu rychlému stanovení ~70 prvků v geologickém vzorku d) identifikaci elementárních nečistot v tenké povrchové vrstvičce vzorku 10. Jaký je původ lorentzovského profilu píků v FT-ICR-MS? 11. Jaká je vzájemná orientace ekvipotenciální hladiny U a vektoru intenzity elektrického pole E? 12. Jaký bude rozdíl rychlosti dvou iontů o m = 100 a.m.u., z = 2, počáteční rychlosti v01 = 100 m/s a vQ2 = 200 m/s po urychlení potenciálem 1 kV a 10 kV? Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 464 Otázky 13. Existuje praktický limit maximální m/z TOF MS? 14. Srovnejte možná uskalí stanovení peptidů a oligomerů DNA pomocí MS. 15. Máte analyzovat peptidy v polévce. Co nebudete přídávat do polévky před MS analýzou? Jak polévku upravíte a jakou ionizační techniku použijete? 16. Který z detektorů je vhodnější pro iontovou past: MCP, channeltron, elektronový násobič, fotografická deska nebo Faradayův pohár? 17. Jaký je vliv časové disperze (tvorby iontů během delší doby) na rozlišení iontové pasti? 18. Jaká je m aminokyseliny A, jejího rezidua (v peptidovém řetězci) a jejího immoniového iontu? Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 465 78 Otázky 1. Srovnejte MALDI a ESI (výhody vs. nevýhody). 2. Co můžete říci o 2 různých spektrech téhož peptidu? (Počátek osy m/z nezačíná v nule, měřítka os jsou různá.) S S m/z m/z 3. Pro 2 sousední píky téže látky v ESI-hmotnostním spektru byly změřeny tyto hodnoty: (m/z)1= 1000.3 a (m/z)2 = 1500.1. Určete nominální m analytu. 4. Doba letu iontu C2H8O2N v TOFMS je 14.8 ms. Jaká je hmotnost iontu, který dorazil k detektoru za 8.94 ms? O jaký iont může jít? 5. Jaké veličiny mají vliv na rozlišení v TOFMS? Pozitivní nebo negativní vliv? 6. Porovnejte počty iontů, které mohou být detegovány během záznamu jednoho spektra v FT-ICR-MS a v kvadrupólovém filtru? Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2010 463