Orientované systémy (1995 - 2000) Orientované systémy - membránové proteiny L Orientované systémy - membránové proteiny Dipolární interakce 2 Orientované systémy - membránové proteiny P IS EMA: Polarization Inversion Spin Exchange at Magic Angle Orientované systémy - membránové proteiny PISEMA: Polarization Inversion Spin Exchange at Magic Angle 1 ^Orientované systémy - membránové proteiny J PISEMA: Polarization Inversion Spin Exchange at Magic Angle 15 5 r^\e d \X C \ / dx.doi.org/10.1006/jmre.2001.2405 -5 -15 2D0 150 100 50 0 o (ppmj Orientované systémy - membránové proteiny Magic Angle-Oriented Sample Spinning (MAOSS) to ' i ' fi ' 4 ' í ' Ů"' -i ' -4 ppm Mi 20 0 20 40 ppir Nanokrystalické proteiny - příprava vzorku L Ubiquitin Nanokrystalické proteiny - příprava vzorku L 3C CP/MAS NMR (800 MHz 1H) Nanokrystalické proteiny - příprava vzorku 13C CP/MAS NMR (800 MHz 1H) Příprava nanokrystalickcých vzorků 1. Proteiny dodala firma Sigma 2. Směs proteinového roztoku a krystalizačního roztoku 1:1 (P.C.Weber, Overview of Protein Crystalization Methods, vol. 276, San Diego, 1997, 13-21). 3. Roztok obsahuje asi 100 mg proteinu. 4. Roztok byl pomalu koncentrován na cca. polovinu počátečního objemu (centrifugační odparka). 5. Teplota 25C a doba zahušťování byla 15-40 min. 6. Inkubace probíhala pň 4C. 7. Jako srážecí činidlo byl použit PEG. Bacillus subtilis protein Crh Bacillus subtilis protein Crh Anja Böckmann, Adam Lange, Anne Galinier, Sonn Luca, Nicolas Giraud, Michel Juya, Henrike Heise, Roland Montserret, Francois Penin, Marc Baldus. Solid state NMR sequential resonance assignments and conformational analysis of the 2x 10.4 kDa dimeric form of the Bacillus subtilis protein Crh, J. Biomol. NMR 27, 323 (2003). Intra-reziduální korelace: 1. 2D (1Q-1Q) PDSD - krátká spin difusní perioda (jdeno- až tri-vazebné interakce) 2. 2D (2Q-1Q) - krátká excitační perioda pro DQC (identifikace jedno-vazebné interakce) 3. 2QF experimenty - rozlišit a identifikovat spinový systém blízko diagonály Inter-reziduální korelace: 1. Kombinace NCACB a NCOCACB experimentů umožňuje sekvenční přiřazení 2. Dvojitá cross-polarizace - frekvenčně selektivní experimenty SPÉCI FIC CP 3. DQC *í7 : ■■v tZKuV , i ,|fiJ NCOCACB(b) A 4*.„„l, * Bacillus subtilis protein Crh Anja Böckmann, Adam Lange, Anne Galinier, Sorin Luca, Nicolas Giraud, Michel Juya, Henrike Heise, Roland Montserret, Francois Penin, Marc Baldus. Solid state NMR sequential resonance assignments and conformational analysis of the 2x 10.4 kDa dimeric form of the Bacillus subtilis protein Crh, J. Biomol. NMR 27, 323 (2003). Porovnání chemických posunů s monomerní strukturou v roztoku Korelace disperze chemických posunů - deuterace Mikrokrystalický protein Crh (catabolite repression histidine containing phsphocarrier protein) D-proteir + D decoupl i o > .. ft.* *'" * lv. l" D-proteir o • «- vr * * ŕ .■ * ' H-proteir ~":,*f . 5r- 200 1B0 160 140 120 100 80 60 40 20 13C Chemical Shift (ppm) Aplikace: mikrokrystalické proteiny Lokalizace vody - detekce 1H NMR signálu A. Böckmann, M. Juy, E. Bettler, L. Emsley, A. Galinier, F. Penin, A. Lesage, Water-Protein Hydrogen Exchange in the Micro-Crystalline Protein Crh as Observed by Solid State NMR Spectroscopy, Journal of Biomolecular NMR , 32 195 (2005). Anne Lesage,Lyndon Emsley,Francois Penin,and Anja Bockmann, Investigation of Dipolar-Mediated Water-Protein Interactions in Microcrystalline Crh by Solid-State NMR Spectroscopy, JAmChemSoc 128, 8246 (2006). 2D 1H-13C HETCOR - mikrokrystalický systém , f JL» LU "no a i HE- g 1 ;« 69 Detekce imobilizovaných i pohyblivých molekul (rezidenční čas -jednotky ns) Přímá chemická výměna H20-OH Detekce zcela imobilizovaných a fixovaných molekul (rezidenční čas -jednotky y&) Mikrokrystalický protein Crh (catabolite repression histidine containing phsphocarrier protein) a-Spectrin Sh3 Domain L a-Spectrin Sh3 Domain L Castellani, F., van Rossum, B.J., Diehl, A., Schubert, M., Rehbein, K., and Oschkinat, H. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy, Nature 420, 98-102 (2002). oc-Spectrin Sh3 Domain L Castellani, F., van Rossum, B.J., Diehl, A., Schubert, M., Rehbein, K., and Oschkinat, H. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy, Nature 420, 98-102 (2002). oc-Spectrin Sh3 Domain L oc-Spectrin Sh3 Domain L 3D struktura prionových proteinů (2005) L M2 protein chřipky A: alosterický mechanismus inhibice L supramolekulární struktura proteinů L 13C-15N zfTEDORNMR Dynamika proteinů Souhrn Membránové proteiny PISEMA □HQPU-iF Příprava proteinových vzorků