Práce se sekvenčními daty (DNA) II. část N ej častej š í typy analýz sekvencí DNA Vyhledání otevřených čtecích rámců (ORF) Analýza využití kodonů Párové přiložení sekvencí, stanovení identity a podobnosti Vyhledání motivů v sekvencích Reštrikční analýza in silico Návrh sekvencí oligonukleotidů ■ primery pro PCR ■ primery pro sekvenování ■ hybridizační sondy Vyhledání otevřených čtecích rámců (ORF) ORF (Open Reading Frame) Sada překládaných kodonů mezi iniciačním a terminačním kodonem j ORF Finder http://www,ncbi,nlm.nih.qQv/qorf/qorf.html ♦ Výsledek je závislý na použitém genetickém kódu ♦ U prokaryot, které nemají introny je základem hledání genů ♦ U eukaryot zpravidla využíváme analýzu sekvencí komplementární DNA (cDNA) Analýza využití kodonů (codon usage) Využití synonymních kodonů ♦ není náhodné ♦ je rozdílné u různých genomů, které mají určité preferované kodony pro určité aminokyseliny Databáze využití kodonů http://www.kazusa.or.ip/codon/ The Hutnan Codon Usage Table ! Gly ! GGG i 17.08 i 0.23 j Arg ! AGG 112.09 | 0.22 j Tm j TGG 114.74 j 1.00 j Arg j CGG 110.40 j 0.19 j ! Oty j GGA i 19.31 i 0.25 ! Arg j AGA i 11.73 i 0.21 I End I TGA I 2.64 ! 0.61 ! Arg i CCA ! 5.63 i 0.10 I ! Cly ! GGT 113.66 J0.18 ! Ser ! AGT | 10.13 | 0.14 ! Cy? j TGT ! 0.09 j 0.42 j Arg j CGT j E.16 j 0.09 ! I Oly ! OOC j 24.94 ! 0.33 I 5er I AGC 116.54 ! 0.2 5 I CVS I TGC I 13.86 I 0.5S I Arg I CGC I 10.S2 I 0.19 I ! Clu j GAG j 38.82 jO.SO ! Lys I AAG j 33.70 j O.SO ! End ! TAG ! 0.73 ! 0.17 j Gin j CAG j 32.05 j 0.73 ! I Glu ! GAA ! 27.51 | 0.41 I Lys \ AAA ! 22.32 ! 0.40 I End I TAA I 0.g5 I 0.22 ! Gin | CAA | 11.94 | 0.27 I I Asp i GAT 121.45 i 0.44 | Asn ! AAT ! 16.43 I 0.44 j Tyr | TAT j 11.80 I 0.42 i His ! CAT j g.56 i 0.41 | I Asp i GAC i 27.06 i 0.55 | Asn | AAC ! 21.30 ! 0.56 j Tyr | TAC | 16.48 I 0.58 i His j CAC 114.00 j 0.59 | Nejčastější typy vyhledávání v sekvencích reštrikční místa repetice DNA ♦ přímé ♦ obrácené (vlásenky, vlásenky se smyčkou) konsenzní vzory uživatelsky definované vzory Reštrikční analýza in silico Reštrikční endonukleázy třídy II ♦ Sekvenčně specifické endonukleázy, které štěpí DNA v rozpoznávaných sekvencích ♦ Přehled dostupný v databázi REBASE- Restriction Enzyme Database http://rebase. neb.com/rebase/rebase. html Sekvence rozpoznávacích míst Producent enzymu Reference Komerční dostupnost Sekvence genů Krystalografická data Citlivost k metylaci ♦ REBpredictor- predikce rozpoznávací sekvence u nových enzymů Rebase genomes - identifikace genů pro RE v genomech Software pro reštrikční mapování Konstrukce restrikčních map na základě analýzy sekvence DNA -vyhledání restrikčních míst ♦ Nezbytný předpoklad pro klonování ♦ Interpretace RFLP polymorfizmu Simulace výsledků gelové elektroforézy restrikčních fragmentů j Virtuální klonování Vytvoření kvalitní grafiky ilustrující reštrikční mapy ♦ RestrictionMapper (http://www. restrictionmapper.org/) WebCutter (http://www.fi rstmarket.com/cutter/cut2.html) ♦ NEB Cutter v2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/) ♦ EMBOSS Restrict (http://bioweb. pasteur.fr/seaanal/interfaces/restrict. html) Restriction Maps (http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper/index.html) pDRAW32 (http://www.acaclone.com/) Výsledky reštrikční analýzy in silico Enzymy, které sekvenci neštěpí Enzymy, které štěpí - počet a pozice rozpoznávacích míst Lineární nebo kružnicová mapa sekvence se znázorněním pozice restrikčních míst ♦ Grafika ♦ Identifikace ORF a translace do proteinu Klonování in silico, konstrukce vektorů Kombinace segmentů sekvencí ♦ známé/neznámé funkce Plazmidy ♦ přebírané z databáze ♦ zpravidla známé funkce Inzerty - obvykle nové sekvence ♦ charakterizované reštrikční mapou ♦ charakterizované sekvencí DNA ♦ charakterizované funkcí Nomenklatura pro konstrukty není stanovena Vector NTI [pBR322] File Edit View Molecule Analyze Gel DB List Tools Window Help J^| a| _ □ ^ General L± DHA Plasmii ATCC 37017 length: 43 storage ty; form: Circ s9 Function; El (Ll CDS [3 El Hi MiscJeJ El (Ml Promoti □ ll RBS (2 | UJJ 151 CTTGGTTATG GAACCAATAC CCGGTACTGC GGCCATGACG CGGGCCTCTT gcccggagaa GCGGGATATC CGCCCTATAG GTCCATTCCffl caggtaaggS 201 ■acagcatcgc ■tgtcgtagcg CAGTCACTAT GTCAGTGATA GGCGTGCTGC CCGCACGACG TAGCGCTATA ATCGCGATAT TGCGTTGATG ACGCAACTAC ■CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG ^ Ready 200 bp-1200 201 bp E A Navrhování sekvencí primerů ■ Polymerázová řetězová reakce Modifikované oligonukleotidy na 5-konci pro klonování Oligonukleotidy jako hybridizační sondy pro realtime PCR Syntéza obou řetězců u specifické sekvence 5' 3' T T GAGAAAGGAATAAGCAGAAT T CGT T C CAAAAAGAAT GAGC TGTTGTTT GCAGAAAT C GAGTATAT GC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' | Přímý (forward) <íntps 3 pnmer j T T GAGAAAGGAAT AAGC DNA POJ AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNAPOL TCTTTAGCTCATATACG dNTPs Zpětný (reverse) primer 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' Design primem pro PCR Relativně snadná výpočetní záležitost -prohledávání sekvence a identifikace krátkých sekvencí splňujících určitá kritéria ♦ Délka primem ♦ Obsah G+C ♦ Teplota Tm Specificita ♦ Komplementarita příměrových sekvencí ♦ Sekvence 3'-konce Jedinečnost primem ■ Na jedinečnost primem a jeho hybridizační vlastnosti (annealing) má vliv délka primem a velikost templátové DNA ♦ Délka (17-28 bází dlouhé) ■ Možná hybridizační místa primem by se také neměla nacházet na DNA tvořících případné kontaminace vzorků Templátová DNA 5'...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3' v Primer 1 5' -TGCTAAGTTG-3' Není jedinečný! Primer2 5' —CAGTCAACTGCTAC-3' Jedinečný! Zastoupení bází Zastoupení bází ovlivňuje vlastnosti hybridizace a reasociace primem Žádoucí je náhodná distribuce bází bez oblastí bohatých na AT nebo GC Obvyklý obsah G+C, který poskytuje stabilní hybridy je 40-60 %, ale závisí také na obsahu G+C templátu Templátová DNA 5'...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3' 13DIVO1MDDDDD1 1~~I. YO T^DDDDDT ♦ mají Tm teplotu 50 - 65 °C T = 0,3 x rPrimer + 0,7 x rProdukt - 25 a ' in ' in kde Tm Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a Tm Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) 7-a=7-m-5°C nejsou komplementární navzájem na 3'-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy neobsahují vnitřní sekundární struktury ♦ Chybně navržená dvojice primem, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci: 5, ATTCAACCGTTCAAACAAGCCC 3' 3' GTTCGGCCTACCTTTATTTCTC 5' ♦ Správně navržená dvojice primem, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: 5' CGAAATAAGACTAGTAAAGC 3' I I I I I I I 3' CCTTACTCCACGCCTAATACAATCC 5' ♦ Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku: 5'TTTTTCAAGG-III C 3' AAAAGAGAT-" Hairpin 3" GGGAAA-^ I I I I i 5' TATCTAGGACCTTA-J 3' GGGAA-^ II 1 A 5' TATCTAGGACCTTA--1 Self-Dimer S bp 31 GGGAAAATTC C AGGATC TAT 51 I I I I I I I I 5' TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3' 4 bp 31 GGGAAAATTC C AGGATC TAT 51 I I I I 51 TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3 1 Dimer forward primer 5' TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3' I I I I I 3' C ATGGAAAC G TAGGAGAC 5' reverse primer ♦ na matricové DNA nemají falešná vazebná místa Nesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy na templátové DNA: 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II I I I I I I I I MM 3'(948) tttcttacccttttt-tacc (966)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II II I II MIMI 3'(1191) tttgtattgcattatatacc (1210)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II I I I I I I I I I I 3'(395) tccatttttctttttatctt (414)5' Správně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: 5Y2476) CCTAACÄTAATCCGCÄCCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I III 3'(787) t a a at c t at t agttt acacat aacc (811)5' 5Y2476) CCTAACÄTAATCCGCÄCCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I I I 3'(3211) caattgtaactat aactgcgtt ate (3235)5' 5Y2478) CCTAACÄTAATCCGCÄCCTCATTCC (2452)3' I I I I I III m 3'(1194) g t attgeattat at acctctgtt ag (1218)5' 5Y2476) CCTAACÄTAATCCGCÄCCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I II I 3'(1469) atattgta-tatacgaactaaatct (1 492)5' Kdy je primer ještě primerem? Pro návrh primerů se obvykle používá specializovaný software Dot display mode Bar graph mode I Lower Primer False Priming Sites j mm M13MP1S Lover Primer - Ml 3MP1 8 :631 OL19 (positive strand} Priming efficiency of the perfect match is 42S (above the threshold) Priming efficiency : 428 iabove the threshold) 5(6328) GGTTTTCCCAGTCFlCGRCG (6310)3' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3"(6328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5' Priming efficiency : 205 tabove the threshold) 5 (6328) GGTTTTCCCFlGTCFlCGRCG (6310)3" III I I I I IIIIII 3"(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5' Priming efficiency : 194 (above the threshold) 5(6328) GGTTTTCCCflGTCňCGňCG (6310)3' II I Mill I I I I 3'(808) gtaatatggtcagtcctgc (790)5" Priming efficiency : 185 (above the threshold) 5(6328) GGTTTTCCCňGTCňCGRCG (6310)3' I II IIIIII III 3'(5125) tctcragtggtctagtg-tgc (5108)5' Priming efficiency : 121 5 (6328) GGTTTTC-CCňGTCňCGňCG (6310)3' I I I I I I I I I I I I I I 3'(5989) agaaaagtggtc-gctctgc (5971)5" Lever Primer - Ml 3MP1 8 :631 0L19 (negative strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : VĚ 5'(6328) GGTTTTCCCňGTCňCGRCG (6310)3' I I I I I I I I I I I 3'(5744) ccaaaaagcgggaaactgc (5762)5' I Current Olino i pCBluŠ.seq Sequence Length: 1842 Current Oligo (+ strand) 5' CCCGCCTG ATG A ATGCTC ATC 3' Length: 21-mer 5' Position: AG (25 °C): Degeneracy: P.E.*: 1373 72.1 °C -42.7 kcal/it 492 5.30 nmol/A260 34.0 /íg/A2Ě0 Current Oligo (- strand) 5' G ATG AGC ATTC ATC AGGCGGG 3' P.E.*: 537 4.SO nmol/A260 31 .7 rg/A2Ě0 1/E: 1 Selected Primers 1 pCBIu3.seq pCBIu3 :269L 21 Upper Primer 5' CGGCGCC AG ATCTGGT ACCC A 3' Length: 21-mer 5' Position: 2Ě9 Tm: 7Ě.9 °C AG (25 °C): -46.1 kcal/mol Degeneracy: 1 P.E.*: 542/542 1/E: 5.12 nmol/A260 33.1 /íg/A2Ě0 pCBIu3:817L21 Lover Primer 5' T ACCGGGTTGG ACTC A AG ACG 3' Length: 21-mer 3' Position: S17 Tm: Ě9.5 °C AG (25 °C): -41.4 kcal/mol Degeneracy: 1 P.E.*: 502/502 1/E: 4.89 nmol/A260 32.0 rg/A2Ě0 _ Optimal Annealing Temperatu : 53.3° (Max: 72.0°) Position and Length Tm [°C] GC [%] P.E.* Product 1352 S8.0 51 .3 Upper Primer 37 21 72.2 47.6 452 Lover Primer 1368 21 79.9 57.1 506 Product Tm - Upper Primer Tn Primers Tr.-i difference: 15.S 7.6 Concentration Upper Primer 200.0 nM Lover Primer 200.0 nM Monovalent Cation 50.0 mM Free Mq[2+] 0.7 mM Terminal stability of "the Lover Primer is too high. Total Na[+] Equivalent: 133.8 Počítačový návrh primerů Umoňuje řada molekulárně biologických programů Některé jsou volně dostupné na internetu ♦ GCG Primer3 ♦ OligoExplorer ♦ BioTools ♦ WebPrimer ♦ PrimerBlast Kalkulátory vlastností primerů ♦ Oligo Analyzer fhttp://eu.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx?cat=DesiqnAnalvze) BioMath lhttp://www.promeqa.com/biQmath/calc11 .htm) Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) ^'Primer3 Input (version 0.4.0) - Mozilla Firefox 5oubor Úpravy Zobrazení Historie Záložky Nástroje Nápověda ( \Y http: //frodo, w\, mit, edu/prirner3/input, htm ft ' £1T Google P w Primer3 Input (version 0.4.0) PrilTlCr^ (v. 0.4.0) Pick primers from a DNA sequence. Checks for lmsiuiuuiig in template. disclaimer Primer3 Home PrimerSplus interface cautions FA0/WIK3 Paste source sequence below (5'->3', string of ACGTNacgtn -- other letters treated as N -- numbers and blanks ignored). FASTA format ok. Please N-out undesirable sequence (vector, ALUs, LINTEs, etc.) or use a Mispntning Library (repeat library): NONE >Sa44kin□□1 [org=Staphylococcus aureus] [strain=CCM 885] [clone=7/IV] Staphylococcus aureuss EcoRI-clone from common. 44 kto Srnal fragment gaattcaaaaccagcaaaagctgtgaaaaagccattaccaagtaaagataatttggctatattgtatggagaaggatttcatatttgtaaaggcg aattatttggaaaacatcgacatggtgaagattgtctgttctgtttagaagttttaagtgattaatcaagcacactcaaatagtgttataattat aaatgaatatggtttggataagtctgagacaatgcatgtttcaggctttaattgtgtataaagttttggtgattgcataagagatggcggtacta aatgttattattaagtgtgcacgcagtatcattagttataaaatgtagctgttaaaagtcaaaaatacatcgaatgtagttaggcatataatata[v] r>1 si 0 Pick left primer, or use left primer below: D Pick hybridization probe (internal oligo), or use oligo below: 0 Pick right primer, or use right primer below (5' to 3' on opposite strand): Pick Primers Reset Form Sequence Id: Targets: A string to identify your output. E.g. 50,2 requires primers to surround the 2 bases at positions 50 and 51. Or mark the source sequence with [ and ]: e.g. ...ATCT[CCCC]TCAT.. means that primers must flank the central CCCC. ^-Jm.^m^t^.^s-4-^-1-,-:. e.g. ...ATCTTCAT.. forbids primers in the central CCCC. Product Size Ranges 150-250 1 00-300 301-400 401-500 501-600 601-700 701-350 351-1 000 Number To Return Max Repeat Mispriming Max Template Mispriming Max 3' Stability 9.0 12.00 12.00 Pair Max Repeat Misprirning Pair Max Template Mispriming 24.00 24.00 Pick Primers Reset Form General Primer Picking Conditions; Primer Size Min: 13 Opt: 20 Max: 27 Primer Tm Min: 57.0 Opt: 60.0 Max: 63.0 Product Tm Min: Opt: Max:- Primer GC% Min: 20.0 Opt: .Max:. 30.0 Max Tm Difference: 100.0 Table of thermodynamic parameters: Breslauer et al. 1 986 v --íl ,ri, tr E Hotovo ® Primer3 Output (p rime r3_resu Its. cgi release 0.4.0) - MoziMa Firefox [-IfPl^^ Soubor Úpravy Zobrazení Historie Záložky Nástroje Nápověda I t ^ (w http: //Frodo, wi, mit, edu/cgi-bin/primer3-web-cgi-bin-0,4,0/prirmer3_results, cgi ^ 3 " í >ogle ý--' \V Primer3 Output (pNmer3 results.cgi. PRIMER PICKING RESULTS FOR SA44kto001 [org=Staphylococcus aureus] [strain=CCM 885] [clone=7/IV] Staphylococcus aure No niispr iming library specified Using 1-toased sequence positions OLIGO start len _tni _gc^ any 3' seq LEFT PRIMER 159 2 5 57.21 32.00 6.00 2.00 kkTCkkGCkCkCTCkkkTkGTGTTk RIGHT PRIMER 42 9 2 5 58.40 3 6.00 4.00 3.00 AACTCCTATGAAGACAACCTTTTTC SEQUENCE SIZE: 2052 INCLUDED REGION SIZE: 2052 PRODUCT SIZE: 271, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 TARGETS (start, len)*: 200,200 1 GAATTCAAAACCAGCAAAAGCTGTGAAAAAGCCATTACCAAGTAAAGATAATTTGGCTAT 61 ATTGTATGGAGAAGGATTTCATATTTGTAAAGGCGAATTATTTGGAAAACATCGACATGG 121 TGAAGATTGTCTGTTCTGTTTAGAAGTTTTAAGTGATTAATCAAGCACACTCAAATAGTG >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 181 TTATAATTATAAATGAATATGGTTTGGATAAGTCTGAGACAATGCATGTTTCAGGCTTTA >>> ***************************************** 241 ATTGTGTATAAAGTTTTGGTGATTGCATAAGAGATGGCGGTACTAAATGTTATTATTAAG ************************************************************ 301 TGTGCACGCAGTATCATTAGTTATAAAATGTAGCTGTTAAAAGTCAAAAATACATCGAAT ************************************************************ 3 61 GTAGTTAGGCATATAATATAAAAAGAGTTTTCAATTACTCAATAGAAAAAGGTTGTCTTC *************************************** <<<<<<<<<<<<<<<< <1 nu I___\y\ Hotovo Oligo |._.o Ligo 7 Demo - Human elF-4E.seq File Edit Analyse Search Select Change View Window Help a, id iá ... & J0 f^l; Sequence File: Human elF-4E.seq DMA Sequence Selected Oligo Position Length # frMk Location Sequence Length: 1868nt JH B Forward Primer 997 22 1 fsource 8. .1850 Reading Frame: +1 Jl' ■ Reverse Primer 1061 21 Current Oligo Length: 21 nt JD Q Upper Oligo 956 21 Position: 956 J_LI 0 Lower Oligo — — ID W 49.1 "C iE PCR Product [85,- -]nt i ,» ,100 ,155 |3B ,ZS) tXO ,MO ,jo0 <» ho fffl fiOO ftfl ,700 ::(■ ;co eso wo |9£0 |10od |10£o .noo ,nso .1200 .lad .1200 .12*0 .1400 .nso .isoo .i«o .iwo .i«o .17tjo .ireo .iwů —^— im- IM—■■ ■■ !■ ~ KV n—i ■■■»■■-■-■■p i ■■ -1 ■■■■■ ■■ pj-pj Iii in mi ■■ ■■■■■■■■ BBH * -' "—■—" ■—™™---"-■- pos: tm: 9S0 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 10«! 1050 1060 TGGCATTTCTATACTTTACAGG -............................. ACATACAGATTTTAC CTATC C......................... ATTACCATTAATTACATACAGATTTTACCTATCCACAATAGTCAGAAAACAACTTGGC^ TAATGGTAATTAATGTATGTCTAAAATGGATAGGTGTTATC AGTCTTTTGTTGAAC C GTAAAGATATGAAATGTC CTTTTTTTTAAGAC AACAAGGTAAAATAC GTCTTC GTATAAAAC GAC C AAACTTTCTAATACTAC GTi .......................................................C GAC CAAACTTTCTAATACTA ITIHTIQILPIHNSQKTTWHFTTLQEKKFCCSILCRSIFCUFERL C I 111111111111111111 pěady? Výsledky ■ Výběr optimálního páru primem ■ Sekvence primem ■ Délka primem a hodnota Tm ■ Velikost produktu ■ Posouzení sekundárních struktur ■ Podmínky reakce ■ Alternativní primery Pokročilý návrh primem ■ Alelově specifické primery ■ Molekulární diagnostika ■ Vícenásobné detekce - primery pro multiplex PCR ♦ Zajištění kompatibility primerů v reakci ■ Konsenzní primery ♦ Pro klonování ♦ Pro PCR-RFLP (např. 16S rRNA) ♦ Vyžaduje identifikaci konzervativních oblastí na základě mnohonásobných přiložení sekvencí (multiple alignment) ■ Primery pro modifikaci konců produktů PCR Modifikace konců DNA, Připojení sekvencí prostřednictvím 5'-konců primerů 5' 3" 5' Cílová sekvence 3" 5" Denaturace j a připojení primerů 1 a 2 Primer 1 5' GCGCAAGCrr Hinó\\\ 5" gcgcaIagctt 3' CGCGTTCGJftA 3'< | PCR Target region 0řTAAGCCGG 5' Primer 2 ti sticky foot" Eco Rl gIaattcggcc ctta^gccgg Přidávané sekvence ♦ RE místa ♦ Promotory ♦ Terminátory ♦ Translační signály Další technologie vyžadující návrh oligonukleotidů ■ Real-time PCR ♦ TaqMan ♦ Molecular Beacons ■ Primer extension ■ Sekvenování ♦ Sangerovo sekvenování ♦ Pyrosekvenování ■ Ligázová řetězová reakce ■ Oligonukleotidy pro microarrays