Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
FRAKCIONACE BUNĚK / SEPARAČNÍ A
ANALYTICKÉ TECHNIKY / PROTEINY / LIPIDY /
NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY /
FRAKCIONACE BUNĚK / SEPARAČNÍ A
ANALYTICKÉ TECHNIKY / PROTEINY / LIPIDY /
NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY /
 HOMOGENIZACE TKÁNÍ, BUNĚK, CENTRIFUGAČNÍ
TECHNIKY
 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, SEPARACE A
ANALYTICKÁ STANOVENÍ, MALDI TOF
 PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HOMOGENIZACE TKÁNÍ / BUNĚK
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
CENTRIFUGACE / ULTRACENTRIFUGACE:
úhlový rotor výkyvný rotor
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE:
izolace subcelulárních frakcí
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
CENTRIFUGACE V SACHARÓZOVÉM GRADIENTU
(např. izolace nukleárního receptoru s navázaným ligandem)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Kapalinová chromatografie (LC, HPLC)
PUMPA
DÁVKOVÁNÍ
KOLONA
DETEKTOR
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC /LC/SPE: typy stacionárních a mobilních fázíHPLC /LC/SPE: typy stacionárních a mobilních fází
 REVERSNÍ FÁZE
nepolární stacionární fáze (C18, C8, fenyl) vs.
mobilní fáze se snižující se polaritou
(voda/metanol, voda/acetonitril/THF)
 NORMÁLNÍ FÁZE / IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE
polární stacionární fáze (amino-, OH-) vs. mobilní
fáze se zvyšující se polaritou
 GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE
 AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
specifické zakončení stacionární fáze (protilátka,
SH- apod.), rozdělení na základě specifických
interakcí
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC /LC: typy detektorůHPLC /LC: typy detektorů
 FOTOMETRICKÝ (změna absorpce, jedna vln. délka
nebo diode array detektor spektrum analytu)
 FLUORIMETRICKÝ (změna fluorescence, jedna
excitační a jedna emisní vln. délka nebo diode
array)
 RADIOMETRICKÝ (sloučeniny značené 3H, 13C, 32P,
33P)
 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR (stanovení m/z)
 další detektory
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Uspořádání spektrofotometrického
a fluorimetrického detektoru
zdroj světelného paprsku
emise fluorescence
absorpce světla
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
 generování iontů (ionizace elektronovým paprskem
aj.)
 separace iontů podle poměru hmotnost / náboj
(m/z)
– nejčastěji ionizace, vznik pozitivních iontů (M+) a
event. specifická fragmentace molekul;
- chemická ionizace (nepřímá ionizace reakčním
plynem jako je metan, amoniak) – vznik
intenzívního iontu M+1;
- separace iontů, např. kvadrupólový analyzátor
 měření množství jednotlivých iontů – hmotnostní
spektrum v daném časovém bodě; chromatogram:
osa x: čas, osa y: vybraný parametr, např. m/z.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Typické spektrum z MS
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption
Ionization Time of Flight Mass Spectrometry):
základní uspořádání
TOF spektrum ( t = (m/z)1/2konverze dat: hmotnostní spektrum
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption
Ionization Time of Flight Mass Spectrometry):
ionizace vzorku
(matrix + analyt)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
nízkotlaká LC, SPE: separace bílkovin a nízkomolekulárních
látek (nukleotidy, metabolity, xenobiotika)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Gelová filtrace: separace standardních bílkovin /
spektrofotometrická detekce
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Gelová filtrace s radiometrickou detekcí
specifickou pro značený substrát a metabolity
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Iontová chromatografie
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Ionexová HPLC:
rozdělení proteinů
zvyšující se iontovou
silou mobilní fáze
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Afinitní chromatografie
Na sorbentu
navázaný
substrát,
protilátka,
koenzym
apod.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
PŘÍKLADY HPLC ANALÝZPŘÍKLADY HPLC ANALÝZ
 Koncentrace steroidního hormonu,
stanovení aktivity CYP3A isoenzymů
(6beta-OH-T), CYP19 (T E2)
 Koncentrace mastných kyselin, stanovení
aktivity PLA, COX, LOX apod.
 Stanovení cizorodých látek, které se
obtížně zplyňují nebo jsou termolabilní
(vysokomolekulární PAHs)
 Preparativní HPLC (izolace nukleotidů,
metabolitů, peptidů, protilátek atd.)
 MALDI-TOF (LC-MS velkých molekul –
fragmentovaných bílkovin)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Reversní HPLC analýza PAHs: detekce pomocí diode-array detektoru (DAD)
chromatogr.
záznam při
vybraných
vlnových
délkách
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC analýza hydroxylovaných metabolitů testosteronu (spektrofotometr. det.)
6-hydroxytestosteron
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem
AA
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
AA
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Stanovení aromatázové aktivity (HPLC analýza koncentrace produktu - E2)
E2
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption
Ionization Time of Flight Mass Spectrometry):
příklad stanovení peptidových fragmentů
Fragmenty po rozštěpení vazeb peptidů
Iontová fragmentace peptidu
(ion decay mass spectrum):
- přesné stanovení mol.
hmotnosti;
- primární sekvence
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
UŽITÍ LC PRO FRAKCIONACI VZORKŮ - PŘÍKLAD STANOVENÍ
ORGANICKÝCH CIZORODÝCH LÁTEK
UŽITÍ LC PRO FRAKCIONACI VZORKŮ - PŘÍKLAD STANOVENÍ
ORGANICKÝCH CIZORODÝCH LÁTEK
SAMPLING EXTRACTION
GPC
HIGH-MOLECULAR
FRACTION
PAH FRACTION
ALIPHATIC
FRACTION
NEUTRAL
AROMATIC
FRACTION
SEMIPOLAR
FRACTION
POLAR
FRACTION
PAHs<252 PAHs>252
Silica gel fractionation
hexane DCM/
hexane DCM
methanol
NPAHs, oxy-
PAHs
Aminopropyl silica column
GC
HPLC, GC HPLC
GC GC
carboxy-,
aldehydes etc.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Uspořádání plynového
chromatografu (GC)
Detektory:
FID
ECD (chlor. látky)
MS (rozdělení podle
hmotností fragmentů)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GC: Přechod látek mezi stacionární a mobilní fází
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GC/ECD (electron capture detector): princip detekce
Ni63 Ni63
= -zářič
anoda
e-enosný
plyn + analyty
Cl + e- Clvychytávání
elektronů
chlorovanými látkami,
snížení el. proudu
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
C h ro m a to g ra m P lo ts
P lo t 1 : c:\... \ sa ze _ 2 _ 2 5 .1 0 .2 0 0 4 _ 2 µ l z 3 0 0 _ ric .sm s R IC a ll
P lo t 2 : c:\... \ sa ze _ 2 _ 2 5 .1 0 .2 0 0 4 _ 2 µ l z 3 0 0 _ 2 0 2 .sm s Io n: 2 0 2 a ll
P lo t 3 : c:\... \ sa ze _ 2 _ 2 5 .1 0 .2 0 0 4 _ 2 µ l z 3 0 0 _ 2 2 8 .sm s Io n: 2 2 8 a ll
P lo t 4 : c:\... \ sa ze _ 2 _ 2 5 .1 0 .2 0 0 4 _ 2 µ l z 3 0 0 _ 2 5 2 .sm s Io n: 2 5 2 a ll
P lo t 5 : c:\... \ sa ze _ 2 _ 2 5 .1 0 .2 0 0 4 _ 2 µ l z 3 0 0 _ 2 4 2 .sm s Io n: 2 4 2 a ll
7.5 1 0.0 1 2.5 1 5 .0 1 7 .5 2 0 .0 2 2 .5 25 .0
m in u tes
0
1
2
3
4
5
6
7
M C o u nts
0
1
2
3
4
M C o u nts
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
k C ou n ts
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
k C ou n ts
0
1 0
2 0
3 0
k C ou n ts
R IC al l s az e _2 _ 2 5.1 0 .20 0 4 _ 2 µ l z 3 00 _ ri c .s m s
Io n : 2 0 2 a ll s a z e_ 2 _2 5 .1 0.2 0 0 4_ 2 µl z 3 0 0 _2 0 2 .s m
Io n : 2 2 8 a ll s a z e_ 2 _2 5 .1 0.2 0 0 4_ 2 µl z 3 0 0 _2 2 8 .s m
Io n : 2 5 2 a ll s a z e_ 2 _2 5 .1 0.2 0 0 4_ 2 µl z 3 0 0 _2 5 2 .s m
Io n : 2 4 2 a ll s a z e_ 2 _2 5 .1 0.2 0 0 4_ 2 µl z 3 0 0 _2 4 2 .s m
Naphthalene
Acenaphthylene
Acenaphthene
Fluorene
PhenanthreneAnthracene
Fluoranthene
Pyrene
Benz[a]anthracene
Chrysene
Benzo[b]fluorantheneBenzo[k]fluoranthene
Benzo[a]pyrene
Benzo[c]chrysene+
Indeno[1,2,3-cd]pyreneDibenz[a,h]anthracene
Benzo[ghi]perylene
Fluoranthene
PAH202_2
Pyrene
Benzo[c]phenanthrene
Benz[a]anthracene
Chrysene+Triphenylene
PAH228_1
Benzo[b]fluorantheneBenzo[k]fluorantheneBenzo[j]fluorathene
Benzo[a]fluoranthene
Benzo[e]pyrene
Benzo[a]pyrene
Perylene
2-MePy
4-MePy1-MePy
242No.1
242No.2
242No.3
242No.4
242No.5242No.X1242No.72-MeBaA7-MeBaA9-MeBaA1+4+6-MeBaA3-MeChry
242No.X2
2-MeChry3+5-MeBaA
6-MeChry5-MeChry
4-MeChry1-MeChry
10-MeBaA
GC/MS:
analýza PAHs
(SIM – fragmenty M+
= různé MW)
MW 202
MW 228
MW 252
MW 242
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ ENZYMATICKÉ AKTIVITY /
ENZYMOVÁ KINETIKA
STANOVENÍ ENZYMATICKÉ AKTIVITY /
ENZYMOVÁ KINETIKA
 E + ES [ES] E + P
 Stanovení produktu:
koncentrace produktu / čas . prot.
= pmol produktu / min. (mg prot./ml)
 Příklady stanovení:
- fluorimetrické stanovení produkce resorufinu
(EROD, MROD, PROD, BROD);
- HPLC stanovení metabolitů mastných
kyselin, např. 5-OH-FA (5-LOX);
- chemiluminiscenční stanovení luciferázy
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Enzymová kinetika: ustálený stav (steady state)
E + S [ES] P + E
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍSUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
spektrofluorimetrická detekce produktu enzymové reakce –
silně flureskujícího resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm)