Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SPEKTRÁLNÍ METODYSPEKTRÁLNÍ METODY
 SPEKTROFOTOMETRIE / TURBIDIMETRIE /
FLUORIMETRIE / LUMINOMETRIE
 STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT
- stanovení hladin enzymů;
- sledování genové exprese (reportérový gen);
- aktivace enzymů (např. PLC v signální transdukci)
- vizualizace proteinů a NA na gelech
 IMUNOHISTOCHEMICKÉ BARVENÍ
- proteiny, nukleové kyseliny;
- barvení organel; morfologie buněk
 DALŠÍ INTRACELULÁRNÍ EFEKTY
- stanovení koncentrace Ca2+, thiolových skupin
(GSH, proteiny); membránový potenciál, pH;
- cytotoxicita / viabilita / proliferace / apoptóza
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
TYPY SPEKTERTYPY SPEKTER
 Absorpční spektrum: spektrum vnějšího záření je
ochuzeno o frekvence (vln. délky), které odpovídají
rozdílům energií buzených atomů (např. žlutá barva
látky odpovídá absorpčnímu pásu 435-480 nm, červená
490-500 nm, modrá 580-595 nm)
 Energii molekuly lze vyjádřit součtem energie
elektronové, energie vibrační a energie rotační
(E = Eel + Evib + Erot):
- UV + VIS (absorpce - excitace valenčních elektronů),
event. absorpce a emise (luminiscence);
- IR absorpce - excitace rotač. a vibr. stavů molekuly IR
absorpční spektrum);
- mikrovlny - excitace rotač. stavů molekuly (mikrovlnná
abs. spektra) a excitace nepárových elektronů v magn.
poli (paramagnetická resonanční spektra)
- radiovlny - excitace atomových jader (NMR spektra)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SPEKTROFOTOMETRIESPEKTROFOTOMETRIE
Mnoho chem. látek pohlcuje elektromagnetické záření ve viditelné a ultrafialové
oblasti (např. žluté pohlcené světlo – cca 580-595 nm; barva látky: modrá)
Absorbance (= jak mnoho světla bylo pohlceno látkou / měřeným roztokem):
A =  (konstanta) x délka průchodu kyvetou x koncentrace látky
(koncentrace je úměrná absorbanci)
Varianty detekce:
- diodové pole (diode array);
- mikrodestička;
- užití jako detektor
v kapalinové chromatografii
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
FLUORIMETRIEFLUORIMETRIE
Princip: elektrony chem. látky jsou excitovány světlem určité vlnové délky;
při návratu excitovaných elektronů se část energie promění v teplo, část je
vyzářena ve formě světla o nižší energii (= vyšší vlnové délce). Měří se intenzita
vyzářeného světla v úhlu 90 stupňů; v určitém rozmezí úměrná koncentraci použití
standardníhbo roztoku event. kalibrační křivky (více známých
koncentrací měřené látky).
- spektrofuorimetr;
- fluor. microreader;
- fluor. detektor v HPLC;
- fluor. mikroskop
- atd.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
FLUORIMETRICKÁ DETEKCEFLUORIMETRICKÁ DETEKCE
- enzymové aktivity
(fluorogenní substráty)
- histochemická detekce
- koncentrace látek
(Ca2+, DNA, NH2-, SH-)
- pH
- membránový potenciál
- fluidita membrán
-derivatizace analytů
pro detekci v HPLC
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
PŘÍKLAD EXCITAČNÍHO A EMISNÍHO SPEKTRA
FLUORIMETRICKÝCH ČINIDEL
PŘÍKLAD EXCITAČNÍHO A EMISNÍHO SPEKTRA
FLUORIMETRICKÝCH ČINIDEL
Příklad užití:
exc. a emisní spektrum
resorufinu
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ /
PŘÍKLAD STANOVENÍ BIOMARKERŮ OX. STRESU
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ /
PŘÍKLAD STANOVENÍ BIOMARKERŮ OX. STRESU
Biotransformační
enzymy
Antioxidanty
(enzymy a
nízkomol. látky – GSH)
Produkce ROS
Produkty oxid. stresu
(lipidní peroxidace)
Zánětlivé procesy
(LOX, COX, cytokiny aj.)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍSUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
CYP1A1/1A2/1B1 (Ethyl-, Methyl-), CYP2B/3A (Pentyl-, Benzyl-)
spektrofluorimetrická detekce resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Stanovení aktivit
CYP enzymů
založené na
chemiluminiscenční
detekci luciferinu
(chemiluminiscence =
přímái přeměna chem.
energie na světelnou;
na rozdíl od fluorescence
není třeba vnější zdroj
světla)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍSUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
CYP3A4 (detekce: spektrofotometrické stanovení HCHO)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍSUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
Glutathion-S-transferázy (GST); spektrofotometrická detekce; různá substrátová
specifita jednotlivých isoenzymů; neselektivní substrát CDNB:
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ ENZYMOVÉ AKTIVITY REPORTÉROVÝCH
PROTEINŮ
STANOVENÍ ENZYMOVÉ AKTIVITY REPORTÉROVÝCH
PROTEINŮ
 Chloramfenikolacetyltransferáza (CAT):
- separace 14C-chloramfenikolacetátu pomocí TLC;
- substrát značený BODIPY
 -Galaktosidáza (-D-Gal) pomocí značeného fluorogenního
substrátu:
- 4-methylumbelliferyl--D-Gal (360/449 nm, modrý produkt);
- fluorescein--D-Gal (490/514 nm, zelený produkt);
- resorufin--D-Gal (571/585 nm, červený produkt)
 Luciferáza: chemiluminiscence (luciferin + ATP)
 Green Fluorescent Protein (GFP) - autofluorescence, pro stanovení
hladiny exprese není třeba vnější substrát
 Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát, 4-methylumbelliferylfosfát)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍSUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
STANOVENÍ EXPRESE REPORTÉROVÉHO GENU CAT
BODIPY FL 1-deoxychloamfenikol
(fluorescenční detekce)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ
STANOVENÍ EXPRESE (AKTIVITY) REPORTÉROVÉHO GENU LUCIFERÁZY
chemiluminiscenční detekce
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
AKTIVITA REPORTÉROVÉHO GENU - LUCIFERÁZY INDIKUJE
AKTIVACI RECEPTORU: AhR-dependentní genová exprese
TCDD and Related
Compounds
LightLight Luciferase
Nuclear
Factors
1
P
+ AhR
HSP90
HSP90
Src
HSP90
HSP90
Adapted from Blankenship (1994)
DRE-Luc
AhR
ARNT
Modulation of Gene
Expression
ARNT
Src
“Activated”
2
P
P
Cytosolic
Proteins
Membrane
Proteins
Increased Protein
Phosphorylation
TCDD and Related
Compounds
LightLight Luciferase
Nuclear
Factors
1
P
+ AhR
HSP90
HSP90
SrcSrc
HSP90
HSP90
Adapted from Blankenship (1994)
DRE-Luc
AhR
ARNT
Modulation of Gene
Expression
ARNT
Src
“Activated”
2
P
P
Cytosolic
Proteins
Membrane
Proteins
Increased Protein
Phosphorylation
Luciferin + ATP
Oxyluciferin + ADP + h
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
JAK MŮŽEME STANOVIT INDUKCI
GENOVÉ EXPRESE ?
JAK MŮŽEME STANOVIT INDUKCI
GENOVÉ EXPRESE ?
 Příklad - stanovení transaktivace AhR:
- exprese reportérového genu, chemiluminisceční
stanovení luciferázové aktivity (DR-CALUX)
- stanovení exprese CYP1A1 mRNA (RT-PCR)
- stanovení hladiny proteinu CYP1A1 (Western blot)
- stanovení enzymové aktivity CYP1A1 (EROD)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMŮ APOPTÓZY
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMŮ APOPTÓZY
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
PRODUKCE ROSPRODUKCE ROS
Dihydrorhodamine 123
difunduje přes buněčné
membrány a je oxidován
na fluorrescenční
Rhodamine 123
(citlivý především na H2O2,
dále peroxynitrit a HOCl)
2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate
(dichrorofluorescindiacetát) je po vstupu
do buňky podroben esterázové reakci;
detekuje ROS včetně NO (H2O2, superoxid,
peroxyl HOO.
)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
PRODUKCE ROSPRODUKCE ROS
H2O2, superoxid, HO.
,
HOCl, NO, HOO.
H2O2, superoxid
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮSTANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ
- spektrofotometricky (absorbance 280 nm);
- různá činidla selektivní na aminokyselinové zbytky, nejužívanější je
stanovení pomocí kyseliny bicinchoninové (bicinchoninic acid, BCA):
Primární substrát:
CuSO4 .5 H2O;
Cu(II) je proteiny redukován
na Cu(I) a ten je detekován
pomocí BCA;
fotometrické stanovení,
i v 96-jamkových destičkách;
kalibrace na BSA;
nízká citlivost metody na
přítomnost detergentů
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ KONCENTRACE Ca2+STANOVENÍ KONCENTRACE Ca2+
Calcium-sensitivní chemická sonda
(zvyšující se koncentrace Ca2+
zvyšuje fluorescenci při excitaci
340 nm; detekce 510 nm)
Fura-2/AM (acetoxymethylester) má
nízkou fluorescenci; po vstupu do
buňky je hydrolyzován esterázami na
Fura-2)
Existuje řada fluorogenních sond, klasickým příkladem je Fura-2:
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLUSTANOVENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
JC-1
závislost na pH
červený agregát JC-1
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Lumigen PS-3
Expozice filmu
nebo exc. 430,
em. 503 nm
ECL Plus Western Blotting Detection Reagents
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
DALŠÍ DŮLEŽITÉ SPEKTRÁLNÍ METODYDALŠÍ DŮLEŽITÉ SPEKTRÁLNÍ METODY
 Fotometrická detekce lipidní peroxidace pomocí kyseliny
thiobarbiturové (detekuje hydroperoxidy lipidů)
 Stanovení aktivity NADPH oxidáz a „konzumace“ NADPH v
buňkách (snížení absorpce při 340 nm)
 Stanovení cytotoxicity, viability, proliferace buněk
- MTT (methylthiazoltetrazoliumbromid) se v mitochondriích
přeměňuje na barevný nerozpustný formazan (pro kvantitativní
stanovení je rozpustěn po inkubaci buněk s SDS)
- XTT produkuje rozpustnou formu formazanu (opět
fotometrická detekce
- Neutrální červeň - příjem do buněk
- Kombinace calcein AM (fluorogenní esterázový substrát zelený
produkt) + ethidium homodimer-1 (ten vstupuje jen do
mrtvých buněk a barví NA červeně)
 Další informace např. v užitečném katalogu firmy
Molecular Probes (www.probes.com)