Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
LIPIDY: FUNKCE, IZOLACE, SEPARACE, DETEKCELIPIDY: FUNKCE, IZOLACE, SEPARACE, DETEKCE
 FOSFOLIPIDY
chemické složení a funkce v buněčných
membránách; metody stanovení fosfolipidů
fosfolipázy - produkty reakcí (ceramid, DAG = 2nd
messengers) a stanovení enzymových aktivit lipáz
 MASTNÉ KYSELINY
chemické struktury mastných kyselin;
mastné kyseliny - 2nd messengers a prekursory
dalších lipidních signálních molekul
stanovení aktivity LOX, COX, CYP
 POUŽITÍ INHIBITORŮ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE
PLA2, PI-PLC, PC-PLC, DAG-lipáza;
inhibitory LOX, COX, CYP
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
LIPIDOMICSLIPIDOMICS
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Fosfolipidové membrány
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GLYCEROLFOSFOLIPIDY / FOSFOLIPÁZYGLYCEROLFOSFOLIPIDY / FOSFOLIPÁZY
R1, R2:
mastné kyseliny
R3:
cholin
etanolamin
serin
inositol
aj.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GLYCEROLFOSFOLIPIDYGLYCEROLFOSFOLIPIDY
Fosfatidylinositolspecifická
fosfolipáza C
a fosfolipáza D
(reakce fosfatidylcholinspecifické
fosfolipázy C
není znázorněna)
Co stanovujeme:
- složení fosfolipidů;
- hladiny DAG, ceramidu..;
- produkci mastných kys.
a metabolitů mastných
kys. (AA, prostaglandinů,
leukotrienů aj.)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SFINGOFOSFOLIPIDYSFINGOFOSFOLIPIDY
SMáza
SMsyntáza
PC-PLC
Různé funkce ceramidu
v různých typech buněk
(aktivace PK, fosfatáz,
apoptotické signály)
Funkce DAG:
(aktivace PKC,
proliferační signály aj.)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
PREKURSORY A BIOAKTIVNÍ
MOLEKULY – CÍL ANALÝZY
PREKURSORY A BIOAKTIVNÍ
MOLEKULY – CÍL ANALÝZY
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ MEDIÁTOROVÝCH LIPIDNÍCH
MOLEKUL
STANOVENÍ MEDIÁTOROVÝCH LIPIDNÍCH
MOLEKUL
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮSTANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ
HPTLC:
Fosfolipidy odvozené od glycerolu – skupinová analýza;
Sfingomyeliny – skupinová analýza;
Izolace skupiny pro další analýzu (LC/MS)
LC/MS:
Stanovení jednotlivých fosfolipidů
- analýza celého vzorku (lyzátu buněk, liposomů apod.);
- izolace HPTLC – analýza LC/MS;
- separace skupin na kolonce SPE – analýza LC/MS
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
TLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ A LIPIDOVÝCH METABOLITŮTLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ A LIPIDOVÝCH METABOLITŮ
Příklad stanovení PC-PLC:
- buňky značeny [14C] cholinem a
[3H] kyselinou myristovou
(inkorporace do PC)
- extrakce lipidů (CHCl3:MeOH)
- separace TLC
- spray s barvičkou (primulin)
- separace TLC v 2. mobilní fázi
Proč stanovujeme fosfolipidy:
- složení buněčných membrán
- složení fosfolipidů v liposomech
- kontrola čistoty izolovaných
fosfolipidů
- stanovení enzymových aktivit
(PLA2, PI-PLC, PC-PLC, PLD)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
„PHOSPHOLIPIDOMICS“ (HPTLC)„PHOSPHOLIPIDOMICS“ (HPTLC)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
„PHOSPHOLIPIDOMICS“ (TLC + LC/MS)„PHOSPHOLIPIDOMICS“ (TLC + LC/MS)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮHPLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮHPLC STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ CERAMIDŮ A DAG METODOU
HPTLC
STANOVENÍ CERAMIDŮ A DAG METODOU
HPTLC
13DAG
Chol
12DAG
MAG
Cer(2) FFA
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
FLUOROGENNÍ ANALOGA LIPIDŮFLUOROGENNÍ ANALOGA LIPIDŮ
Příklad užití:
- stanovení enzymových
aktivit SMázy, SMsyntázy
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ PLA2FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ PLA2
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ AKTIVITY PI-PLC POMOCÍ WESTERN BLOTUSTANOVENÍ AKTIVITY PI-PLC POMOCÍ WESTERN BLOTU
 Stimulace buněk, lyze
 Imunoprecipitace (protilátka proti PI-PLC + protein
A - Sepharose)
 PAGE a transfer proteinů na membránu
 Protilátka proti PI-PLC nebo proti fosforylovanému
tyrosinu (detekce aktivované formy enzymu)
 Vizualizace proteinu (ECL)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
VZNIK MASTNÝCH KYSELINVZNIK MASTNÝCH KYSELIN
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MASTNÉ KYSELINYMASTNÉ KYSELINY
NASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY: METODA STANOVENÍ:
- máselná (4:0)
- laurová (12:0) HPLC, fluorimetrická derivatizace
- myristová (14:0) HPLC / radiometrická nebo
- palmitová (16:0) refraktometrická detekce
- stearová (16:0) GC po derivatizaci (methylaci)
NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY:
olejová (18:1)
linolová (18:2, příklad n-6 kyseliny) HPLC / fluorimetrická detekce
linolenová (18:3) nebo HRGC/MS
arachidonová (20:4)
eikosapentaenová (20:5)
dokosahexaenová (22:6)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem
AA
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
AA
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
METABOLISMUS MASTNÝCH KYSELINYMETABOLISMUS MASTNÝCH KYSELINY
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MASTNÉ KYSELINY (CYP ENZYMY ZODPOVĚDNÉ ZA
OXYGENÁZOVÝ METABOLISMUS)
MASTNÉ KYSELINY (CYP ENZYMY ZODPOVĚDNÉ ZA
OXYGENÁZOVÝ METABOLISMUS)
Detekce a
kvantifikace
metabolitů
pomocí HPLC
nebo GC/MS
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
KYSELINA ARACHIDONOVÁ - PREKURSORKYSELINA ARACHIDONOVÁ - PREKURSOR
Stanovení aktivit COX a LOX:
GC/MS nebo HPLC metabolitů AA
COX
LOX
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STRATEGIE DETEKCE KLÍČOVÝCH SIGNÁLNÍCH
DRAH MECHANISMŮ TOXICITY XENOBIOTIK
STRATEGIE DETEKCE KLÍČOVÝCH SIGNÁLNÍCH
DRAH MECHANISMŮ TOXICITY XENOBIOTIK
EXPOZICE TESTOVANÝMI LÁTKAMI
AKTIVACE ENZYMŮ
MODULACE BUN.
CYKLU, PROLIFERACE,
MEZIBUNĚČNÝCH
SPOJENÍ
MODULACE SIGNÁLNÍ
TRANSDUKCE A
GEN. EXPRESE
SPECIFICKÉ
INHIBITORY
Specifické inhibitory
CYP, COX, LOX,
PLA2, PI-PLC, PC-PLC,
a MAPK; antioxidanty
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SIGNAL TRANSDUCTION
PATHWAYS
Membrane Receptors
Ras, Rho, PLA2, PLC
Arachidonic Acid, Reactive
Oxygen Species, Ca2+,
DNA Damage
Protein Kinases (ERK1/2, JNK,
p38, PKB/Akt, PKC, PKA, c-Src)
Protein Phosphatases
Transcription Factors,
Modulators of Gene Expression
(AhR, ERs, CAR, NKB, AP-1,
c-Jun, c-Fos, c-Myc, p53)
CELLULAR EVENTS
Mitogenic signal transduction
Cell cycle modulation
Regulation of apoptosis
Modulation of intercellular
communication
(SPECIFIC PROTEIN TARGETS)
(e.g. ERK1/2, ERs, c-Myc)
(p53, p21, pRb, CDKs, GADDs)
(TNFR, Fas, p53, Bax, Bcl-2, Casp)
(Cx 43, Cx32)