§ nativní – pozorování skutečného tvaru, pohybu § fixovaný barvený - barvení buněčné stěny nebo struktur, buňky jsou usmrcené fixací nad plamenem nebo chemicky (etanolem nebo acetonem), usmrcené buňky lépe přijímají barvivo a lépe přilnou k podložnímu sklíčku Zdroje: Mikrofoto preparátů předmětu Bi7340 (rok 2007) http://www.microbelibrary.org/Gram%20Stain/details.asp?id=2028&Lang= !!Atlas mikroorganismů: http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/mikr.htm Morfologie •Buňky •Charakteristických shluků buněk •Extracelulárních útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra..) •Bakteriální kolonie Většinou druhově charakteristické = identifikační znak Pozor na: fázi růstového cyklu! endospory vyklenující buňku stáří kultury pleomorfní buňky Clostridium botulinum endospora buňka char.shluk kolonie sporangium spory Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Pleomorfní buňky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních buněk. Další potíž: Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní buňky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. Př: Corynebacterium, Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys Bacillus megaterium ccm 2007 (nativni48noma) Bacillus megaterium ccm 2007 (3-nativni24-hallo) sarcina-nativni_5 Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně) Je neznámý vzorek vůbec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem Morfologie buňky •PREPARÁT • - co chceme vidět? – podle toho preparát a typ mikroskopie • tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. • • • • • • pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence • barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra) • typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. • rychlá příprava nativního preparátu barvení buněk a spor za horka a struktur Gramovo barvení světelná mikro- skopie Světelná Fázový kontrast Fluorescenční Elektronová… U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! •Př: tyčky bacilů •Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei •Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens Posuzujeme-li vzhled buňky určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: •1) Prochází tento druh růstovými cykly? •- v každém z nich má pak buňka jinou morfologii! • Př: Chlamydia Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. •Mění se nejen vzhled buňky, •ale buňka v cyklech prochází •typickou změnou vnitřních •struktur. Buněčný cyklus Caulobacter crescentus • Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie Morfologie buňky vprostřed buněčného cyklu • Životní cyklus rodu Bacillus - u některých jeho druhů i u jiných rodů navíc různá barvitelnost Gramem při různém stáří buněk – až gramlabilní při popisu preparátu nutno uvažovat stáří buněk! •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? •- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz Originál je k vidění: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis •3) Stárnutím mění buňky tvar •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí -živiny, tlak, osmolarita… •5) pleomorfní buňky – př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma • Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální buňky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1μm velké buňky se v cyklu střídají s elementár.tělísky výběžky Morfologie bakt. kolonií • •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! • kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií • •Př: sledování morfologie kolonií • – univerzální media, jiný vhled na • selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?) • S-, R- a M-formy • sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) • Proteus Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních půdách Nocardia E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. půdách Jeden druh bakterie různá media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní až na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmenům E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních půdách DSCN0760 Kontaminace na misce! • Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci řetízky koků: Streptococcus řetízky bacilů: Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády koků: Micrococcus balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus Imerzní objektiv: Paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu. Imerzní prostředí - kapalina o stejném n jako krycí sklíčko. Často cedrový olej (n = 1,52). Imerze umožňuje korigovat některé opt. vady mikroskopu. větší index lomu vyšší úhel α vyšší numerická apertura nižší rozlišovací mez NA = 1,2 – 1,4 Pro žlutozelené světlo: Rozlišovací mez 0,4 μ m Suchý objektiv: Paprsek vystupující z preparátu pod úhlem α se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. menší index lomu menší numerická apertura vyšší rozlišovací mez n= 1 NA = max 1 Pro žlutozelené světlo: λ = 550 nm NA = 0,95 Rozlišovací mez = 0,6 μ m Rozlišovací mez δ = λ / n . sin α R. Hook - po 1.olejová lampa Kapalina zvyšuje účinek světla - pozorování světelným mikroskopem - max zvětšení 1500krát, max rozlišení 200 ηm -pozorování pod imerzí – mokré pracovní prostředí umožňuje větší zvětšení, zvyšuje numerickou aparaturu, soustřeďuje světelné paprsky Gramovo barvení •Slouží pro rozlišení G+, G- a pro určení tvaru buněk samotných (koky, kokotyčky, tyčky, spirily, pleomorfní buňky, vlákna) a také jejich uspořádání do charakteristických útvarů (balíčky, řetízky bacilů i koků, tetrády, sarciny) •Grampozitivní – tmavě fialové až modročerné zbarvení - komplex barviva a jódu není vyplaven • Gramnegativní – červené nebo růžové zbarvení – komplex barviva a jódu je odbarven etanolem nebo acetonem a buňky jsou dobarveny safraninem • • Micrococcus luteus CCM 169 -Grampozitivní kok zv. 1000× Preparát: DVOJICE ČTVEŘICE SHLUKY micrococcus4 Jaké bakteriální rody Gramovým barvením neobarvíme? Jedná se o rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie, dále o silně acidorezistentní rody (např. mykobakteria): •Borrelia burgdorferi (fig 1, 2) •Borrelia recurrentis (fig 1) •Bartonella henselae (fig 1, 2) •Chlamydia trachomatis (fig 1, images of elementary bodies, images of reticulate bodies) •Chlamydophila pneumoniae (images of elementary bodies, images of reticulate bodies) •Chlamydophila psittaci (images of elementary bodies, images of reticulate bodies) •Coxiella burnetii (fig 1, 2) •Ehrlichia chaffeensis (fig 1, 2) •Anaplasma phagocytophilum (formerly; Ehrlichia phagocytophilum or E. equi; Fig. 1) •Legionella sp. (fig 2) •Leptospira sp.(fig 1, 2) •Mycobacterium bovis (fig 1) •Mycobacterium tuberculosis (fig 1, 2 thanks to Anders Olav Lande, 3) •Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare (fig 1 thanks to Anders Olav Lande) •Mycobacterium kansasii (fig 1) •Mycobacterium leprae (fig 1, for a close up thanks to Anders Olav Lande) •Mycobacterium marinum (fig 1) •Rickettsia rickettsii (Fig. 1,: scroll down to bottom of the page. 2) •Orientia tsutsugamushi (formerly; Rickettsia tsutsugamushi; Fig. 1) •Treponema pallidum(fig 1, 2, 3) Micrococcus luteus CCM 169 • micrococcus Micrococcus luteus CCM 169 • C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokolo7\luteusgram.jpg • sporosarcina1 Sporosarcina ureae CCM 860 G+ koky Preparát: Sarciny (= balíčky po 8) Dvojice Shluky Staphylococcus • Zdroj: http://www.microbelibrary.org/Gram%20Stain/details.asp?id=2028&Lang= Jednotlivé buňky Dvojice Hrozníčky Streptococcus • Jednotlivé buňky Různě dlouhé řetízky C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\andrea\protokol_1_mikroskopie\G+\ bacilluscereus1.jpg Bacillus cereus CCM 2010 -Grampozitivní tyčka zv. 1000× Preparát: DVOJICE JEDNOTLIVÉ BuŇKY ŘETÍZKY - C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\bs2cereus.jpg Bacillus cereus CCM 2010 • bacilluscereus Bacillus megaterium CCM 2007 •Preparát: •Jednotlivé •buňky •(velké) • •Dvojice • •Řetízky bacillusmegaterium Bacillus thuringiensis CCM 19 • bacillus cv1-19 • bacillussphearicus1 Bacillus sphaericus CCM 1615 G+ tyčky C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\andrea\protokol_2_motrfologiebune kGram\streptomycesgriseus1.jpg Streptomyces griseus ssp. griseus CCM 2386 G+ vlákna zv. 1000× streptomycesgriseus5 • saccharomycescerevisiae Saccharomyces cerevisiae - eukaryotický typ b., barví se grampozitivně!! saccharomyces1 – – – – Escherichia coli ( G- krátké tyčky) – 2-3 x 0,4-0,6 um – – –Bacillus cereus CCM 2010 –( G+ tyčky) • b.cereus.bs.jpg e.coli_gram2.jpg Serratia marcescens CCM 303 -Gramnegativní tyčka zv. 1000× Preparát: Jednotlivé drobné tyčinky - C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\andrea\protokol_2_motrfologiebune kGram\G-\serratia.mer.jpg • 2se-rgam Serratia marcescens CCM 303 Gramnegativní tyčka zv. 1000× Preparát: Jednotlivé drobné tyčinky C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\andrea\protokol_2_motrfologiebune kGram\G-\serratia3.jpg Serratia marcescens CCM 303 G- tyčka zv. 1000× • p Pseudomonas fluorescens CCM 2115 G- tyčky