Mikrobiologický rozbor vody – hlavní zdroje nepřesností RNDr. Dana Baudišová Výzkumný ústav vodohospodářský TGM, PrahaÚvod Stanovení koliformních a termotolerantních (fekálních) koliformních bakterií Stanovení koliformních a termotolerantních koliformních bakterií bylo rozděleno na několik problémových okruhů, které jsou charakterizovány v tabulce 1. Každý problémový okruh byl studován zvlášť a v následující pasáži jsou podány hlavní výsledky. Charakter vzorku Tato problematika není přesně součástí mikrobiologického rozboru vzorku vody, již nesprávně odebraný vzorek však může být příčinou mezilaboratorních rozdílů. Z informací uvedených v úvodu vyplývá, že pro jakákoliv porovnávání výsledků (mezilaboratorních i vnitrolaboratorních) je nutno používat pouze vzorky paralelní. Ty musejí být získány z jednoho vzorku odebraného v jeden okamžik, z jednoho místa, do jedné vzorkovnice a poté za maximálního stupně homogenizace rozděleného na jednotlivé podíly. Očkování vzorku Očkování vzorku (včetně jeho homogenizace) je zdrojem největších nepřesností při mikrobiologickém rozboru vody. Toto bylo jednoznačně potvrzeno výsledky experimentů: Byly stanoveny koliformní a termotolerantní koliformní bakterie, kdy jeden vzorek byl v devíti paralelách naočkován třemi pracovníky. Odečtení všech vzorků provedl jeden pracovník, aby byly vyloučeny další nepřesnosti. Zjistilo se, že při pečlivém promíchání vzorků podle předpisu a přesném pipetování vzorku (při použití skleněných pipet správného objemu) lze dosáhnout rozptylu mezi naočkovanými paralelami vyjádřeného hodnotou variačního koeficientu pod 10 %. Při nedbalé práci však variační koeficient může dosahovat hodnot až 50 % (!!). Živné médium Byl studován vliv živného média na záchyt koliformních a termotolerantních koliformních bakterií. K záchytu koliformních bakterií byl použit Endo agar, k záchytu termotolerantních koliformních bakterií agar mFC. Média byla připravena podle standardně užívaných předpisů, jednotlivé várky připravili tři různí pracovníci z jedné laboratoře. Kromě připravovatele se várky lišily stářím (za dodržení skladovacích předpisů), nebo např. použitou destilovanou vodou. Zjistilo se, že pokud jsou dodrženy všechny předpisy ohledně přípravy kultivačního média, toto prakticky neovlivňuje získané výsledky. Variační koeficient mezi výsledky (n = 3*10) získanými na třech “různých” médiích byl 4 % u koliformních (Endo) i termotolerantních koliformních (mFC) bakterií. Analýza rozptylu (Anova) prokázala, že výsledky koliformních bakterií na Endo, resp. termotolerantních koliformních bakterií na mFC jsou shodné (F 0,651479, resp.0,191255 F kritická 3,354131). Inkubace Vliv inkubační teploty (resp. vliv kolísání teploty v předepsaném rozmezí) na záchyt koliformních a termotolerantních koliformních bakterií byl studován pomocí paralelní inkubace naočkovaných vzorků ve dvou termostatech, u každého se předpokládá určité kolísání teploty podle deklarace výrobce, nemělo by však přesáhnout 1 °C. Nebyly zjištěny významné rozdíly mezi paralelními soubory ze dvou termostatů. Pro stanovení koliformních bakterií je předepsána inkubační teplota 37 °C +/- 1 °C. Variační koeficient mezi výsledky ze souborů z dvou termostatů byl pouze 2 %. Shodné výsledky prokázala i analýza rozptylu (F 0,139064 F kritická 4,300944). U stanovení termotolerantních koliformních bakterií byly navíc sledovány rozdílné inkubační teploty předepisované různými normami (ČSN 83 0531 a ISO 9308) 42–44 °C. I zde byly rozdíly velmi malé, při rozdílném nastavení o 2 °C se již rozdíl zvyšuje. Odečítání výsledků Vyhodnocování vykultivovaných kolonií a jejich odečítání (resp. rozhodování, patříli do hledané skupiny či nikoliv) je dalším významnějším zdrojem nepřesností při mikrobiologickém rozboru. To se v podstatě netýká analýzy vod pitných, kdy každá “podezřelá” kolonie by měla být dalšími testy ověřena. U povrchových vod to není vzhledem k jejich počtu možné. Výrazného snížení těchto nepřesností však lze dosáhnout použitím kultivačního média s lepší diferenciační schopností. Například při odečítání termotoleratních koliformních bakterií na médiu mFC byl variační koeficient mezi výsledky odečítanými různými pracovníky jen 4 %, zatímco na Endo agaru až 12 %. Výpočty Volba správného ředění a s tím související výpočet výsledku je jedním z hlavních problémů mikrobiologického rozboru vody. Tento problém se zásadně netýká mikrobiologického rozboru pitné vody, kdy je bakterií obecně málo a jsou předepsány objemy, ve kterých se má jejich počet stanovit. Při analýzách vod povrchových je však nutno odhadnout přesně ředění, ve kterém se má daný ukazatel hodnotit. Podle platných ČSN, resp. ČSN ISO, se má vyhodnotit takový stupeň ředění, kdy je na plotnách při přímém výsevu hledaný mikroorganismus v počtech 30–300 ktj na misce, u membránové filtrace je rozmezí 10–100 ktj vzhledem k menší využité ploše. U vzorků neznámého znečištění (a to je vzhledem k sezonním a dalším výkyvům prakticky vždy) se proto musí provádět ředění několik (minimálně dvě, v řadě případů i tři a více), což stanovení samozřejmě časově a finančně zatěžuje. Situaci navíc komplikuje skutečnost, že analýza je neopakovatelná – vzorek se musí zpracovat a zlikvidovat do 24 h po odběru. Nesprávné ředění kromě toho, že poskytuje relativně odlišné výsledky, významně zvyšuje jejich nepřesnost. Při stanovení podílu rozptylu na průměru (vyjádřené variačním koeficientem) u paralelních misek bylo zjištěno, že hodnota rozptylu je výrazně nižší u výsledků vypočítaných ze správného ředění. Stanovení fekálních streptokoků – další zdroje nepřesností Kvalitativní chyby Stanovení fekálních streptokoků má dnes dva stupně: kultivaci vzorku na selektivním médiu s azidem sodným a TTC a konfirmaci typických kmenů testem na hydrolýzu eskulinu v prostředí žlučových solí. Konfirmační testy umožňují odlišení tzv. “pravých” fekálních streptokoků od dalších streptokoků, které nepocházejí ze střevního traktu a dříve způsobovaly falešně pozitivní výsledky, neboť též rostly na selektivním médiu s azidem sodným a TTC. Konfirmační testy je tedy dnes nutno důsledně provádět a odlišovat stanovení tzv. “presumptivních” (čili nejpravděpodobnějších či předběžně určených) a “pravých” fekálních streptokoků. Kvantitativní chyby Fekální streptokoky tvoří nejčastěji diplokoky, mohou se však spojovat i do řetízků. Je zde tedy výrazný rozdíl mezi počtem bakteriálních buněk a počtem kolonie tvořících jednotek. Žádnou závislost zde kvantifikovat nelze. Růst fekálních streptokoků velmi citlivě reaguje na složení peptonu v živném médiu (nejlépe vyhovuje trypton). Při jejich stanovení tedy velmi záleží na typu použitého peptonu v živné půdě a i malá odchylka ve složení může snížit růst (a tedy i záchyt) fekálních streptokoků. Stanovení mezofilních a psychrofilních bakterií – další zdroje nepřesností Kvalitativní chyby Skupina mezofilních a psychrofilních bakterií je velmi nesourodá skupina chemoheterotrofních bakterií uzančně vázaná ke složení kultivačního média. Jakákoliv jeho změna zachytí kvalitativně zcela odlišnou skupinu mikroorganismů (a konečný výsledek může být i kvantitativně odlišný). Kvantitativní chyby Mezofilní a psychrofilní bakterie se podle platných ČSN stanovují přímým výsevem do kultivačního média a tato metoda poskytuje řadu nepřesností pouze omezeně ovlivnitelných: Teplota roztopeného agarového média pro zalévání naočkovaných misek má mít teplotu maximálně 45 °C. Vzhledem k tomu, že médium musí zůstat sterilní, nelze teplotu při zalévání přesně zjistit a každá desetina stupně navíc nepříznivě působí na růst mezofilních a zejména psychrofilních bakterií. Pokud má médium naopak teplotu nižší, stává se viskóznějším a nelze zaručit jeho bezvadné promíchání se vzorkem. Mezi mezofilní bakterie patří i sporulující bakterie, zejména zástupci rodu Bacillus. Pokud se ve vzorku vyskytnou, rostou v obřích koloniích, a i jedna kolonie může přerůst celou misku. Mezofilní bakterie potom nejdou buď spočítat vůbec, nebo je třeba volit tak vysoké ředění, které je pro správný výpočet výsledku nevhodné. Opakovatelnost a reprodukovatelnost výsledků Pro studium opakovatelnosti a reprodukovatelnosti výsledků byl proveden experiment analýz pěti bodových vzorků, které byly paralelně rozděleny pro dva pracovníky z laboratoře VÚV (každý pracovník provedl celé stanovení od začátku až do konce = opakovatelnost) a pro další anonymní laboratoř (reprodukovatelnost). Každý vzorek byl očkován v pěti paralelních stanoveních (membránová filtrace, Endo agar). Výsledky ukázaly normální rozdělení, proto byly hodnoceny standardně pomocí směrodatných odchylek a variačních koeficientů. Při porovnávání výsledků dvou pracovníků z jedné laboratoře (VÚV) se variační koeficienty u koliformních bakterií pohybovaly od 3 do 29 %, u termotolerantních koliformních bakterií od 5 do 23 %. Při porovnávání výsledků jednoho pracovníka z VÚV a pracovníka z jiné laboratoře se variační koeficienty u koliformních bakterií pohybovaly od 0 do 18 %, u termotolerantních koliformních bakterií od 1 do 11 %. Vzhledem k tomu, že výsledky pracovníků ze stejné laboratoře jsou relativně horší než výsledky mezilaboratorní, potvrzuje se, že největší nepřesnosti při mikrobiologických analýzách jsou způsobeny osobními chybami pracovníků. V následující části je demonstrována korelace výsledků 12 analýz koliformních a termotolerantních koliformních bakterií (Endo, přímý výsev), zpracovaných pracovníky dvou různých laboratoří. Vzorky nebyly paralelní, ale jednotlivě odebírané v jednom čase následně z jednoho profilu během roku. Regresní analýza ukázala vysokou korelaci výsledků z obou laboratoří (viz obrázky 1a a 1b). Korelační koeficienty se prakticky nesnížily ani po eliminaci dvou nejvyšších (tj. extrémních) hodnot. Obr. 1a. Koliformní bakterie; lineární regrese výsledků stanovených odlišnými laboratořemi [LINK] Obr. 1b. Termotolerantní koliformní bakterie; lineární regrese výsledků stanovených odlišnými laboratořemi [LINK] Párový T-test na střední hodnotu prokázal, že výsledky obou laboratoří jsou shodné (t-stat. 0,787417 t krit. 2,262159). Variační koeficienty mezi jednotlivými párovými stanoveními však byly relativně vysoké (0–75 %!), u koliformních bakterií průměrně 29 %, u termotolerantních koliformních bakterií průměrně 23 %).