Moderní metody biologického výzkumu Oddělení cytokinetiky Oddělení patofyziologie volných radikálů Oddělení molekulární cytologie a cytometrie Biofyzikální ústav AV ČR v.v.i., Brno Co vás dnes čeká? •Krátká prezentace •Přestavení nejčastěji požívaných metod v naší laboratoři Oddělení Cytokinetiky •Regulace cytokinetických parametrů lipidovými složkami výživy •Interakce lipidů a cytokinů •Působení protinádorových léčiv •Role růstových faktorů v signalizaci nádorových buněk •Molekulární a buněčné mechanizmy toxicity organických látek Tkáňové (buněčné) kultury in vitro •živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd. •Dělení buněčných kultur: –Primární buněčné kultury - vznikají enzymatickým rozvolněním (trypsin, kolagenáza) buněk tkání (bovinní fétus, myší tkáně apod.). Tyto buňky jsou následně kultivovány v kultivačních láhvích v prostředí kultivačního média. Mají diploidní sadu chromozómů a zpravidla jde o směs různých typů buněk původní tkáně (epiteloidní, fibroblasty). –Sekundární buněčné kultury (diploidní) - jedná se o více než jednou pasážované primární kultury. Mají rovněž dipolidní chromozomovou výbavu, ale oproti primárním kulturám obsahují pouze jeden vyselektovaný typ buněk. Lze je pasážovat 30x - 50x, zhruba po dobu jednoho roku. Toto omezení je především kvůli zkracování telomer. –Buněčné linie (heteroploidní) - získávají se cílenou selekcí z primárních kultur pomocí fyzikálních či chemických mutagenů nebo se získávají přímo z nádorových buněk (např. buněčná linie HeLa pocházející z buněk nádoru děložního hrdla). Jsou heteroploidní a lze je pasážovat bez omezení. • •ADHERENTNÍ kultury - rostou přichyceny k pevnému podkladu (kultivační nádobky, mikronosiče) •SUSPENZNÍ kultury - nevyžadují podklad, rostou volně v médiu • Využití buněčných kultur •lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku humorálních faktorů i celkového stavu organismu •lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách •homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů chování těchto buněk •specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství důležitých biologických látek (enzymy, hormony) - hybridomy •etické hledisko - systém omezuje využívání laboratorních zvířat •umělý zjednodušený systém •poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo • Výhody: Nevýhody: Hlavní komerční dodavatelé buněčných linií •The American Type Culture Collection www.atcc.com •The European Collection of Cell Cultures www.ecacc.org.uk • – jaké medium a sérum adherentní x neadherentní organismus jejich obrázek jaké jsou to buňky jak je psážovat . . . Kultivace buněk •Přísná sterilita –práce ve flowboxu, sterilní přístroje a roztoky •CO2 inkubátory –udržení specifických podmínek (95% vlhkost, 5% CO2, 37°C) •Speciální plastik –coating proteiny extracelulární matrix •Kultivační média (glukóza, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, anorganické soli) –specifické složení pro danou buněčnou linii •Sérum •Hormony, růstové faktory… •Antibiotika Kultivace buněk •Udržování kultury – pasážování –určitý počet buněk se po určité době přenese do čerstvého živného prostředí • – – •Adherentní –odsátí média –oplach EDTA/PBS –trypsin • •Neadherentní – část kultury se přenese do nového média • Stanovení proliferace •Coulter Counter –Suspenze buněk v elektrolytu je nasávána do trubice s malým otvorem –Mezi elektrodou uvnitř trubice a zevní elektrodou protéká elektrický proud –Buňka procházející mezi elektrodami přeruší tok proudu a vede k změně napětí –Změna napětí je úměrná objemu částice –Změna napětí musí mít určitou prahovou hodnotu, aby byla započítána Stanovení proliferace •CASY –Základní princip stejný jako u Coulter Counter –Navíc analýza •Viability buněk •Objemu buněk •Agregátů •Debris - „rozbitých buněk“ Stanovení proliferace – další možnosti •Bürknerova komůrka –nejjednodušší metoda – počítání pod mikroskopem Stanovení apoptózy obr4 Aktivace kaspáz Kondenzace buňky a organel Kondenzace chromatinu Ztráta asymetrie buněčné membrány Zachování integrity buněčné membrány Tvorba „bodies“ a jejich fagocytóza okolními buňkami Stanovení apoptózy na různých úrovních procesu… Apoptosis detection using DAPI staining http://springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s13277-010-0036-6-3 http://cytoquant.com/mediac/450_0/media/8cda7dca66452e40ffff84f0ac144225.JPG •Během apoptozy – fragmentace DNA ~ 200 PB •DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) prochází neporušenou cytoplazmatickou membránou •DAPI se interkaluje do DNA – typické „rosety“ pod fluorescenčním mikroskopem •Absorpční maximum ~358 nm (ultrafialová) •Emisní maximum ~461 nm (modrá) • Stanovení apoptózy – další možnosti •Substráty kaspáz •detekce štěpení PARP, proteinů z rodiny Bcl (western blot) •Aktivita kaspáz •Mitochondriální funkce •uvolňování cytochromu c (FACS) •změny membránového potenciálu mitochondriální membrány (rhodamin 123, Mitotracker; FACS) •TUNEL –sledování fragmentace DNA (fluorescenční mikroskop, FACS) •Anexin V –váže se na fosfatidilseriny •Mechanizmy buněčné smrti, význam, metody – RNDr. Alena Hyršlová, Ph.D. (Bi8870) Jakou metodu použít? • více než jednu • principielně odlišnou • v závislosti na buněčném typu SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blotting http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.ht ml http://www.elect-intro.com/western-blots http://www.kollewin.com/blog/read.php?5262&guid=1 •SDA-PAGE elektroforéza – separace proteinů na základě jejích hmotnosti •SDS denaturuje proteiny a obalí je – proteiny mají negativní náboj (úměrný jejich velikosti) •Proteiny v gelu migrují ke kladně elektrodě •Přenos vzorků z gelu na membránu a následná identifikace proteinů pomocí protilátek •Membrány PVDF, nitrocelulózová • 113 89 PARP 32 pro- caspase-3 21 Bax Bak 24 kDa Mcl-1 42 Interakce kys. arachidonové (AA) a dokosahexaenové (DHA) s butyrátem Diferenciace •Rozrůznění buněk vlivem faktorů okolního prostředí • •Při diferenciaci •se mění morfologie buněk •stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické fosfatázy) •stoupá exprese specif. povrchových antigenů (CD11b, CD 14) •vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo chemiluminiscenčně) • Stanovení diferenciace •Změna enzymového vybavení buněk •Nespecifické esterázy - Hydrolýza a-naftyl acetátu esterázami vede k vzniku hnědého zbarvení •Detekce myeloperoxidázy - myeloperoxidáza štěpí peroxid kyslíku za vzniku kyslíkových radikálů, které pak oxidují o-dianisidin za vzniku barevných látek chinonového charakteru •Detekce alkalické fosfatázy - alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení • •Produkce ROS při oxidativním vzplanutí (monocyty) •Redukce NBT (nitroblue tetrazolium) - NBT je redukován superoxidem produkovaným monocyty. Redukce vede k změně barvy ze žluté na modrou •Oxidace/redukce luminolu - ROS produkované monocyty oxidují luminol při redukci – chemiluminiscence • •Změna povrchových molekul •Exprese CD11b (R proC3b složku komplementu) a CD14 (vazba LPS) •Změna morfologie Zvýšená adhese, pseudopodia, zástava proliferace Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29) po působení butyrátu sodného (NaBt) metodou fluorimetrického stanovení aktivity alkalické fosfatázy na přístroji Fluostar (spektrofotometr, fluorimetr, chemiluminometr). Spektrofotometrie = stanovování vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky v roztoku, na základě pohlcování světla v různých vlnových délkách spektra.