Název prezentace v zápatí Středoevropský technologický institut CEITEC CL - proteomika Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Bi 7050 PŘÍPRAVA PROTEINOVÉHO VZORKU PRO MS ANALÝZU Hana Konečná PROTEOM  komplexita 106 ?  dynamika  sekvence  struktura  abundance  lokalizace  modifikace  interakce  biochemická funkce geny - nositelé instrukce proteiny - vykonavatelé instrukce ALTERNATIVY SEPARACE  2D gelová elektroforéza IEF + SDS  1D gelová elektroforéza SDS PAGE BN PAGE…  multidimenzionální LC MudPIT ICAT...  proteinové čipy Functional protein arrays (protein proteinové interakce) Affinity arrays proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduch ý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace I. dvourozměrná gelová elektroforéza 2D GE II. (multidimenzionální) kapalinová chromatografie I. DVOUROZMĚRNÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA 2D GE Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu ANALYZOVANÝ VZOREK - HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí SOLUBILIZACE VZORKU  nekovalentní interakce – denaturace detergenty CHAPS, Triton, Nonidet chaotropy močovina, thiomočovina  disulfidické můstky – redukce  inhibice proteáz, fosfatáz, glykozidáz  odstranění solí, lipidů, polysacharidů, NA DETERGENTY žádný celkový náboj 0.5 – 4% použitelné ve vysokých koncentracích močoviny  neionogenní  zwitterointové SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) CHAPS C7BzO E.coli ZÁKLADNÍ PRAVIDLA  zabránit proteolýze  jednoduchý postup  čerstvé reagencie  čerstvý vzorek  odstranit pevné částice - centrifugace  odstranit kontaminanty KONTAMINANTY  soli, zbytky pufrů  malé endogenní molekuly  iontové detergenty  nukleové kyseliny  polysacharidy  lipidy  fenolické látky 2D GE  první rozměr IEF  druhý rozměr SDS-PAGE ISOELEKTRICKÝ BOD IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty IPG STRIPY překrývající se rozsahy  široký rozsah 3-10, 3-10NL  úzký rozsah  mikro rozsah ROZSAH STRIPU MW pI 3 - 10 NL pI 4 - 7  rehydratace  aplikace vzorku  ochrana cysteinu  fokusační podmínky FOKUSAČNÍ PARAMETRY Protean IEF Cell DRUHÝ ROZMĚR 2 DE GE 3 10 SDS-PAGE ELEKTROFORÉZA DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu po elektroforéze před elektroforézou specifické pro protein specifické pro PTM viditelné spektrum fluorescence BARVENÍ PROTEINU V GELU Coomassie Blue R-250 Coomassie Blue G-250 Stříbro: kompatibilní s MS nekompatibilní s MS Sypro Ruby Flamingo Pink Pro-Q Diamond Pro-Q Emerald 0.6 ng (8 ng) 36 ng 1 - 4 ng Stříbro Coomassie Sypro Ruby CITLIVOST BARVENÍ PROTEINU BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby Ag Sypro Ruby ANALÝZA OBRAZU referenční mapa paralelní vzorky  průměrný gel  kvalita  kvantita  porovnání referenčních map PDQuest BIOMARKER • detekuje přítomnost onemocnění • přispívá k zvládnutí nemoci - předpověď a potvrzení účinku léku staré Řecko – sladká moč dnes asi 150 proteinů klinicky relevantních VALIDACE • analytická stabilní robustní metoda • biologická biochemické dráhy a jejich změny, biologická variabilita u zdravých • klinická prediktivní předpověd klinické změny, › než biologická variabilita personalizovaná medicína vlastní kontroly etické problémy kupka sena Biomarkery onemocnění GvHD v lidské plasmě Den 21 – před klinickým projevem GvHD Den 44 – po klinickém projevu GvHD 2D GE INSTRUMENTACE  Protean IEF  Protean Dodeca Cell  Densitometer GS-800 PDQuest, Quantity One  STORM Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell 2D or not 2D ?  rozlišení  vizuální aspekty  multigelové jednotky  dynamický rozsah  extrémní proteiny (membránové,basické...)  reprodukovatelnost, image analýza  citlivost barvení  pracnost  nesnadná automatizace  postdigesční extrakce 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm odstranění abundantních proteinů HSA VivaPure PROT20 ... Vivapure Kit DEPLECE Apolipoprotein Immunoglobulin kappa light chain Immunoglobulin light chain albumin Lidská plazma - vázaná frakce po afinitní depleci ALBUMIN IgG Barvení: CB G-250 PROTEOMINERPREFRAKCIONACE PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAH pI pI SDS PAGE Protean II Mini-Protean 3 Mini-Protean 3 Dodeca Cell bakteriofág 812 Difference Gel Electrophoresis DIGE separace identifikace depletovaná plasma Calcium-Depleted Human C-Reactive Protein Amyloid related serum protein BSA vesikly kmenových buněk DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTION trypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSEKVF CLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFRSGELLD AIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAKPASAEIGGL KITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLSDSLRLRVIFQD DRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEEANATFSVEHDEET QKASRLVLKVGDQEVKSYDLTGGAYDYTNAIITD INQLPDFEAKLSPFGDKNLESSKLDKIENANIKDK AVYVKAVFGDLEKQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPS NVEVEAGEESATVTATSPIKTIEPFELTKLKGGTN GEPPATWADKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAE VASFVKERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQ ASLSNPRVSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMVA VALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESIDLDE LNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFNDKSDPV KAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQFIGTRTINTS ASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFPAEDVQVIVEGN EARISMTVYPIRSFKKISVSLVYKQQTLQA MS DIGEST BSA v gelu kompatibilní stříbro odbarvený gel gel bez odbarvení KERATINY ! ! ! Potlačení ionizace 1 20 0 17 00 22 00 m /z 5 0 0 10 0 0 15 0 0 20 0 0 25 0 0 a. i. alpha-1-antiproteinase, antitrypsin Score 83 potvrzeno na MALDI-TOF/TOF MS Score 239 Neoznačené píky: keratiny nebo autolýza trypsinu ALTERNATIVA 2D GE II. MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINY A PEPTIDY PRINCIPY SEPARACE KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ Isokratická eluce Gradientová eluce CO ROZHODUJE KOLONA  náboj  hydrofobicita  biospecifická afinita  velikost molekuly ionex reverzní fáze afinitní gelová TYPY LC SEPARACE IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE Isoelektrický bod RP CHROMATOGRAFIE reversed-phase chromatography AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography PHOS Select Iron Affinity gel Kasein Kasein tryptic digest Surový Po aplikaci Surový Po aplikaci GELOVÁ CHROMATOGRAFIE HPLC LC PERFÚZNÍ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE POROS RP SAX WAX SCX WCX HIC Activated Affinity Application-Specific RP Affinity klasický sorbent POROS BioCAD 700E Kolona může vypadat různě . . . C18 C4 MC SCX Zip Tip Millipore Glygen TopTip NuTip MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE kombinace odlišných fyzikálních a chemických separačních principů  diskontinuální  kontinuální  dvoufázová kolona ProteomeLab PF 2D  chromatofokusace  RP MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE PRO  velké objemy vzorku  možnost koncentrace na koloně  membránové proteiny, basické proteiny  není nutno barvit  peptidy – přímé napojení na MS  automatizace  vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr  LC je sériová analýza  GE může běžet současně pro více vzorků PROTI KOMPLEMENTARITA METOD M. Hecker, University of Greisfwald, bakteriální proteom, HUPO 2005 2D GE 2D-LC 168 467 607 13% 49% 38% LITERATURA  R.M. Twyman: Principles of Proteomics  R.Westermeier, T.Naven: Proteomics in Practice  A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols  T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods  Busy Researcher´s Guide to Biomolecule Chromatography  Current Protocols in Protein Science Název prezentace v zápatí G I G O Název prezentace v zápatí G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT III. CENTRÁLNÍ LABORATOŘ CENTRÁLNÍ LABORATOŘ • přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy proteomické techniky genomické techniky • výuka - přednášky a praktické kurzy • členství v Association of Biomolecular Resource Facilities TECHNIKY V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI • sekvenování a fragmentační analýza DNA • syntéza a purifikace oligonukleotidů • kapalinová chromatografie • gelová elektroforéza • analýza obrazu • digesce proteinů • hmotnostní spektrometrie • minisklad reagencií pro molekulární biologii http://www.sci.muni.cz/FGP