D Fyziologie buněčnýc systémů A. Kozubík J. Hofmanová ÚEB (oddělení/specializace) I) Fyziologie a imunologie živočichů Pracoviště PřF MU Kasárna, Terezy Novákové 64, Brno - Řečkovice I BFÚ PřF MU RESENI a další postup Diverzifikace na dvou úrovních: 1) Mezioborová (2 systémy), 2) Odborného směrování (2-3 problematiky) Náročné, ale možné Diverzifikovaný systém - pro většinu stabilnější, méně závislý na jakémkoli neočekávaném vývoji Složení a zaměření oddělení 3-systémová úroveň (organismus, experimentální „základna" populace, ekosystém) 7 Fyziologie buňky (buněčné signalizace) Doc. A. Kozubík Doc, J. Hofmanová Dr V. Bryja Dr, R Krejčí Dr, J, Procházková Dr K, Souček Dr J. Pachemřk (Doc, S. Kozubek, Dr J. Vondráček, Dr M. Machala, Dr Vaculová atd.) Imunologie obratlovců a bezobratlých Doc, A. Lojek Doc. A. Žákovská Dr R Hyršl (Dr. L Kubala, Dr M. Číž, Dr. J. Turánek, atd.....) Fyziologie smyslového vnímáni Doc. M. Vácha NĚKTERÉ HLAVNÍ CÍLE SOUČASNÉHO VÝZKUMU Poznání mechanismů působení látek lipidové povahy, zejména VNMK a jejich derivátů, v mezi/vnitrohuněčných komunikacích podílejících se y ragullacj cyíokjn&'ijky (proliferace, diferenciace a apoptózy) v kontextu jejich interakcí s - fyziologickými regulátory růstu, - environmentálními polutanty - vybranými farmaky. Jedním Z praktických CÍlŮ je využít tylo znalosti v rámci přípravy lipidových nutričních preparátů, případně cytostatik. Organismus jako komplexní hierarchický systém Nelze oddělovat (naopak nutno usilovat) studium na jednotlivých úrovních organizace systému Obtížně realizovatelné v rámci jedné laboratoře Výzkumné cíle a oblasti praktického využití INICIAČNÍ (INITIATION) ONKOGENEZE fáze: PODPŮRNÁ ) (PROMOTION) POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH) BUNĚK „cell signalling" (cytokiny vs. eikosanoidy) klinická data, matematické analýzy, experimentální ověření POPULACE ISFORMOVANÝCH RESIVNI F (PROGRESSION) 11 Negenotoxické hepatokarcinomy (nádorové promotory^ hormony, TCDD)_ Negativní mutagenicita (Nereagují s DNA) Nízkfí dávka Inhibice oxidativního stresu Indukce reparace DNA Inhibice proliferace v oblastech GST-P+ ohnisek Suprese apoptózy Protekce GJIC Aktivace detoxifikačních systémů v játrech (CYP2C11, P-450 NADPH oxidoreduktáza) Buněčná signalizace (GABA, MAP kinázy) Hormetický efekt na karcinogenezi (Inhibice GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) GST-P: glutathion S-transferáza placentami forma Vysoká dávka Indukce oxidativního stresu (P-450, ROS, 8-OHdG) Indukce reparace DNA Zvýšení proliferace v oblastech GST-PH ohnisek Indukce apoptózy Inhibice GJIC Inhibice CYP2C11 Promoce karcinogeneze (Indukce GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) Přesné prahování karcinogenicity Fukushima et al., Carcinogenesis, 2005 12 Přehled metod a metodologií Viz „Metody Metodologie založené na nejmodernějších zařízeních Výhody FCM - Možnost analýz a třídění živých buněk !!! (UV lasery) a jejich postoupení pro další -„Multicolour analyses" - Optimum poměru automatizace / versatilita Metody používané v laboratoři cytokinetiky BFÚ AV ČR, Brno Legenda: FACS - průtoková cytometrie včetně „cell sortingu" FM - fluorescenční mikroskopie SM - světelná mikroskopie WB - western blotting FM - fluorimetrie (FluoStar) CM - kolorimetrie (FluoStar nebo Elisa reader) LM - luminometrie (VUVEL, Lojek) PAGE - polyakrylamidová elektroforéza RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction RG - radiografie ELFO - agarózová elektroforéza SYLABUS pro studenty 4. ročníku fyziologie živočichů a obecné zoologie, mol, biologie, chemie životního prostředí a ekotoxikologie, výběrová přednáška pro doktorandy n - Stručný úvod do teorie systémů n - Negativní a pozitivní zpětná vazba n - Základní pojmy, parametry cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) n - Typy buněčných populací n - Kmenové a diferencované kompartmenty. Totipotentní, pluripotentní, progenitorové, komitované diferencované buněčné populace n - Autokrinní, parakrinní a endokrinní regulace n - Buněčný cyklus a jeho regulace n - Faktory ovlivňující buněčné dělení, cytokiny, růstové faktory a inhibitory, jejich specifita a rovnováha jejich působení n - Struktura plasmatické membrány a její funkce v regulaci buněčné proliferace a diferenciace n - Vysoce nenasycené mastné kyseliny a eikosanoidy n - Transdukce signálů a exprese genetické informace n - Úloha fosfolipidových komponet v transdukci signálů růst modulujících látek n - Mechanismus účinku hormonů a tkáňových mediátorů ( cytokiny a "chalony"). n - Regulace proliferace, diferenciace, apoptózy Krvetvorný systém a jeho funkce n Hemopoéza (lymfopoéza, myelopoéza, erytropoéza, megakaryocytopoéza ) n Funkce diferencovaných krevních elementů - monocyty, makrofágy - fagocytóza; n Vztah imunitního systému k dalším fyziologickým funkcím ( zánětu apod.) Homeostáza, zdraví a nemoc n Organismus jako hierarchický systém, spolupůsobení nervové, endokrinní a humorální soustavy n Příklady systémových reakcí jako jsou stres, zánět apod. a jejich význam z hlediska zdraví a nemoci n Škodlivé faktory vnějšího prostředí a jejich vliv na zdraví lidské populace Doporučená literatura Cell Physiology Source Book, ed. N. Sperelakis Academic Press Inc., 1995 B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publish. Inc., New York 1994 Biochemie, B., Voet, J.G. Voetová: Victoria Publishing, Praha, 1990 Molecular Cell biology, J.E. Darnell: Eds. Darnell, Lodish, Baltimore, 2nd edition, Scientific American Books Inc., New York 1990 J. Neuwirt, E. Nečas: Kmenové buňky a krevní choroby, Avicenum Praha 1981 Základy buněčné biologie - úvod do molekulární biologie buňky, B. Alberts, D. Bray, A, Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Espero Publishing, (orig. 1998) Klinická imunologie, J. Krejsek, O. Kopecký, Nucleus HK, 2004 J. Vácha: Problém normálnosti v biologii a lékařství, Avicenum, Praha 1980 J. Šterzl: Imunitní systém a jeho fyziologické funkce, Čs. Imunol. Společnost, Praha 1993 POJMY A MODELY Typy buněčných populací podle Gilberta a Lajthy (1965) TYPY PROLIFERUJICI expandující, neopouštějí populaci, množí se populace coby zdroj Tranzitní populace, ve buněk pro jiné populace které se buňky pomnoží stacionární c. konstantní c. konstantní c. konstantní NÁDOR K. B. BLASTY KRVE TYPY NEPROLIFERUJICI metamyelocyty B. C.N.S. OOCYTY k. d. erytrocyty granulocyty stále ubývá typ průchozí (tranzitní) c. konstantní 22 Tabulka 1 Dělení buněčných populací podle intenzity obnovy u dospělé myši 1. Statické populace bez známek obnovy během života: neurony všech typu srdeční svalové buňky odontoblasty Sertoliho buňky 2. Velmi pomalu se obnovující buněčné populace: Během života se obnoví jen část populace: hladké svalové buňky gliové buňky osteocyty buňky ledvinných tubulů buňky dřeně nadledvinek hlavní buňky žaludeční sliznice intersticiální buňky Leydigovy buňky hnědé tukové tkáně 3. Rychle se obnovující buněčné populace: A. Ne příliš rychle se obnovující populace. Populace, která se během života zcela obnoví, ale za dobu delší než 30 dní: hepatocyty a litorální buňky epitelová výstelka dýchacího traktu buňky slinných žláz buňky pankreatu buňky v kůře nadledvinek parietální buňky žaludeční sliznice pojivové buňky v kůži B. Velmi rychle se obnovující buněčné populace. Všechny se obnoví za dobu kratší než 30 dní: střevní epitel krvetvorné buňky, prekursory krevních buněk epidermis kornea epitelová výstelka ústní dutiny a esofagu povrchový epitel žaludeční sliznice seminiferní epitelová tkáň C. Buňky nádorové MODELY: Buňky tzv. intenzívně proliferujících populací (zejména b. krvetvorné a b. střevních epitelů). a buňky nádorové (PRAKTICKÉ SOUVISLOSTI) Jestliže dojd( organismu io může dojít k nemoci ozářc RADIAČNÍHO 3fe'ho průběh p k celotělové expozici nizujícím zářením, rozvoji tzv. mí - manifestaci tzv. i SYNDROMU, závisí na dávce ozáření Dobový kontext od 40.- 80. léta 20. stol. Radiobiloqickv výzkum především pro vojenské účely. Důsledky: Utlumení a poškození krvetvorby (intenzívně proliferujících populací) imunitních funkcí a celého organismu. Vznik nádorů včetně leukémií atd. ,smrt. ) (Nevada, USA) Jestliže dojde k celotělovému vystavení ionizujícímu záření, dochází k rozvoji tzv RADIAČNÍHO SYNDROMU provázeného devastujícími účinky na organismus Formy nemoci z ozáření (myš) dávka hlavní oblasti postižení Dřeňová forma.................0.1- 6 Gy.......Kmenové buňky K.D. Střevní forma..................5-10 Gy.......Epitely, zejména střeva Centrálně nervová forma....100 Gy.........Viz výše včetně C.N.S. Důsledky: silné poškození intenzívně proliferujících populací, organismu, imunitních funkcí a celého systému: proliferativní choroby, leukémie, smrt. Využití ozáření jako modelu pro studium regenerace krvetvorných funkcí Princip, volba dávky, volba druhu laboratorního zvířete (myš) Metoda CFU-S Epoxyci«rsAtrienoic acids (EET) ProitlgUndilU (PG) H>dro^koraT£rracr.oic acids (HF.TF.; Arjchidtinit Acid 1AA) Leukotrien« (LT) Hepnriliru (HX1 Lipoxins (LX) Hydroxyeicosat«raerioic acids (HETE) Isopruiiarics (Istt) HydrQxycicosatctraenoic acidi (HETE) BIOLOGICAL MEDIATORS THE ARACHIDONIC ACID CASCADE Fosfolipidový metabolismus a působení ionizujícího záření (škodlivých faktorů životního prostředí) r Re-esterification © Cyclooxygenase o >^y^c=^n^*>v COOH OH OH Prostaglandins Thromboxane Prostacyclin Arachidonic Acid ,COOH (Aspirin Indomethacin) Lipoxygenase 0 ♦ Lipoxins (A & B) Hydroxy Fatty acids (HETEs. HPETEs) TGlu-Cys-Gly I s Leukotriene B4 ifVVV^COOH Neutrophils Macrophages -> Megakaryocytes/ Platelets Basophils/Mast cells Pre-B cells ♦ B-cells SELF-RENEWAL CAPACITY DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT >ĽJ z Ä I LU U E o LU 100 % 50% 0 % Plurípotentní buňka jíž neschopná vytvořit slezinnou kolonii1 - BFU-E ■ CFU-E - CFU-C ■ CFU-eozinofílu ■CFU-Meg - CFU-makrofágů3 -CFU-BL* ■ CFU-TL3 erytroblasty ■ myelocyty • megakaryocyty CFU-S Pluripotente buňky o -c a. Q- Morfologicky rozpoznatelné bunky PROLIFERUJICI BUNKY NEPRQLIFERUJICI BUŇKY Obr. 8. Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. 1 Podle Gregorové a Henkelmana(1977) 2 Podle MacVittieho a Porvaznika (1978) 3 Nejsou odvozeny od CFU-S 34 + >UJ íl" sa ml UJ nj -3 c E Š i- « í E m i — (B ' C "Z ä c ° SI Z I ° ■rn Q. N > JS -ÍB S. S S. I* S 5 r* i! 8 ta a 2 "5 aj >a> "í i 2 Š m ja Pi w u n "š E 'Š e E o.-a w g.= E f I s 1° ROVNOVÁŽNY STAV ROVNOVA STAV ŽNÝ HRANICE (limity): zvýšení rizika optimálního rozmezí optimum optimálního rozmezí nevratného poškození Dosažení dynamické rovnováhy u < CL O CL >LU O CL diferenciace zánik buněk (smrt apoptózou) produkce buněk (intenzita dělení -proliferace) zvýšené riziko vzniku ládorových onemocnění tolerovaná hranice regulovaného rozmezí „homeostázy" na tkáňové úrovni 38 treatment: ovlivňovaný systém parametry cytokinetiky: I I cytostatika, ozařování,... regulační podněty, atd. l VSTUPY modelové systémy in vitro, buňky lišící se růstovou ..strateaií" nacient VÝSTUPY Cl aborcitoř ytokinetiky lliofyzikólní úxtov ftVČtt. HANO 39 některá OBECNÁ VÝCHODISKA, DŮLEŽITÁ PRO POSTIŽENÍ CHOVÁNÍ A SMĚROVÁNÍ BUNĚČNÝCH POPULACÍ, Z NICHŽ LZE VYCHÁZET, MOHOU BÝT TATO: - Zachování rovnováhy v nejširším slova smyslu mezi produkcí buněk (intenzitou proliferace) a jejich úbytkem (např. smrtí apoptózou) je podmínkou pro zachování homeostázv na tkáňové úrovni. - Proto změny v intenzitě proliferace. diferenciace a apoptózv po působení jakýchkoli podnětů, jež mohou tyto procesy ovlivnit, lze chápat jako integrální ukazatele porušení této homeostázy. - Vhodný způsob detekce těch změn, které vedou k trvalejšímu porušení rovnováhy mezi produkcí a úbytkem buněk může celkově odrážet nejen poruchy, které jsou základem tzv. proliferativních chorob (nádorových onemocnění), ale být i ukazatelem procesů vedoucích k obnově porušené rovnováhy. - Parametry, jimiž lze postihnout tyto tendence, by proto měly být předmětem zájmu nejen teoreticky orientovaných pracovníků, ale i laboratoří zabývajících se účinky škodlivých látek vnějšího prostředí, šlechtitelských a zejména klinicky orientovaných laboratoří. Parametry cytokinetiky 7 t0 čas (t) 41 Rovnováha (homeostáza) Výsledek působení mnohočetných zpětných vazeb FAKTORY SPECIFICKÉ FAKTORY NESPECIFICKÉ Příklad interakce dvou faktorů (data: Eur. J. Pharmacol. 316, 349-357, 1996.) 44 REGULACE „NORMÁLNÍHO" RŮSTU 1 w lil í Poly- í Oligo- í Mono- INHIBICE kumulace kata bol itů vyčerpání živin transmem.pot. Em -70 až -90 mV limitní konc. Na+/K+, Ca2+, Mg2+ snížení cGMP~10"8-10-12 mol.ľ1 intracel. zvýšení cAMP 10_2-10-5 mol.ľ1 extr. katabolické steroidy interferon katecholaminy, adrenalin některé mitostat. hormony ACTH některé prostaglandiny inh. myeloidní leukémie inh. epid. karcinomu, ascitu inh. lymfomu, melanomu epidermální, intestinální inh. FGRF, MCIF inh. Atd. BSC-1, BHK-1 inh spec. inhibitory-chalony spec. endogenní inhibitory t Startovací inhibitorová síla (odpověď vše nebo nic) R Ů S T Startovací stimulátorová síla (odpověď vše nebo nic) spec. intracel. stim. proteiny spec. růstové faktory růstové proteiny, kondic.média poietiny, CSF lektiny (A, conc. A) somatomediny některé prostaglandiny EGF, FGF, NGF, MSA atd. některé hormony - mitogenní inzulín, serotonín hydrokortizon, noradrenalin anbolické steroidy zvýšení cGMP 10_3-10_6mol.l_1extr. snížení cAMP pod 108 mol.ľ1 i.c. dodání Ca2+ nad 1,8 mV transmem. pot. Em -10 až -70 mV proteázy, trypsinizace dodání živin odstranění katabolitů STIMULACE 1A Schematické znázornění stimulace a inhibice růstu specifickými a nespecifickými faktory. Převaha pozitivního nebo negativního signálu rozhoduje o výsledné stimulaci nebo inhibiciů závisí na metaboluické a růstové aktivitě buněk, typu buněk a dalších podmínkách - viz text. Specifické růstové účinky vnějšího prostředí buněk zahajují specifické růstové faktory (specifické stimulátory) a specifické endogenní inhibitory (chalony). CSF-kolonie stimulující faktor, EGF-epidermální růstový faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, NGF-nervový růstový faktor, MSA-multiplikaci sti-mulující aktivita, cAMP-cyklický 3'5 -guanosinmonofosfát, BSC-1, BHK-1, MCIF, FGRF-specifické inhibitory daných buněčných linií. Regulace a inhibice růstu normálních a nádorových buněk, Fremuth F., SPN, Praha, 1986 Čtyři n ej důležitější skupiny malých organických molekul v buňkách stavební jednotky buněk jednotky vyssiho radu cukry _ polysacharidy mastné kyseliny tuky (lipidy), membrány aminokyseliny proteiny nukleodity nukleové kyseliny 46 n'.l KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984 n-9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984 n - 6- KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984 The early acting growth factor which maximises host defense MyalokTsiem 0 © w> BFU-E CFU-M*9 GM-CSF IL-3 GM-CSF GM-CSF IL-3 I iL-3 GM-CSF JlL-3 CFU-E EPO m Pro*rythrot>ta*t Megakaryocyte 6 1 Erythrocyte - - - ■ " Monocyte I gm-CSF Jm-CSF Eosinophil IL-3/IK IL-3/IL-4 IL-3/IL-4 Hut Cm IL-3/IL-4 50 T.M.Dexter and M.Moore STEM PROGENITOR CELL MATURE U'ND") CELL COMPARTMENT COMPARTMENT CELL COMPARTMENT Pre-B cells B-eells. SELF-RENEWAL CAPACITY DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT Fig. 1. The structure of the hemopoietic system Seznam používaných zkratek kmenových buněk: BFU-1 - bwsí ftwwiiíttg unií - wytihmM (jednotka vytvá řejíeí explozivně vznikající kolonie erytroidni řady). Velmi nezralá kmenová bu ňka erytroidni řady. CFU-BL - edtony fiitiáng řfíV - B - ry»]|aeyíe' (buňka vytvářející kolonie lyntfoeytů B). CFU-C -(GM-CFC) edtonyfauvftiítguniv - eufatre (jednotky vytvá řejíeí koloniev kultuře). Kmenová bu nka Mé řady, v poslední dob ě stále častěji používaná zkratka GM-CFC - gí^nwtoeyíy j»a«TOptta§e^E©tony íbrartig e^tt1 (buňka vutvářející kolonie pro granulocyty a makrel^),. CFU-E - <ří>to»y fwrtáig inik - myiHaÝátU (jednotka vutvá řejíeí kolonie erytroidni řady.), Kmenová bu ňka erytroidni řady CFU-Meg- cotony fwnting unií - mtgdkaryocyu (jednotka vytvá řejíeí kolonie megakaryocytůX Kmenová bu ňka erytroidni řady. CFU-S -(CFU-GEMM) eoíony fwftávig iívbíí - spteeo (jednotka vytvá řejíeí kolonie ve lsezině).. Nejbéžnejši používaná zkratka pro bernopoetiekou pluripotentní kmenovou buňku. DCPC= dlQwsioíi cfeamber- progeaiíor eett (kemnová progenitorová bu ňka proliferujíeí v difuznkh komůrkách.) -► omezující tendence stimulující tendence -► omezující tendence 55 SIGNAL (např. cytokiny) MOLEKULÁRNI MECHANISMY působení oj-3 a 00-6 VNMI (mediatory a modulátory buněčné signalizační sítě) změny metabolismu, buněčného růstu diferenciace a apoptózy n-3 PUFA n-6 PUFA (AA, LA) • » Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony, polutanty, záře n Q — cas „Moudrost člověka lze měřit podle starostlivosti, s níž myslí na věci budoucí nebo na konec." G. Ch. Lichtenberg 57 Co by mělo být rozhodováno nejdřív: Proč chceme studovat, jaký je opravdový zájem? Na základě čeho se rozhodujeme? Kdy začít a proč? Kde začít? Jaké máme možnosti uplatnění po skončení studia? Nabídka studia bel., dipl. i DSP na našem oddělení (na pracovištích PřF i AVČR v Brně)