Úloha lipidových komponent v buněčných signalizacích a využití protinádorových farmak
(vybrané modely a metody detekce)
A. Kozubík
Biofyzikálni ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů)
Brno
MOŽNÉ CÍLE VÝZKUMU
Poznání mechanismů působení látek lipidové povahy, zejména VNMK a jejich derivátů
v mezi-a vnitrobuněčných komunikacích podílejících se
v regulaci cytokinetiky (proliferace, diferenciace a apoptózy) v kontextu jejich interakcí s
fyziologickými regulátory růstu environmentálními polutanty vybranými farmaky.
Jedním z praktických cílů je využít tyto znalosti v rámci přípravy lipidových nutričních preparátů, případně cytostatik.
Cisplatina
(c/s-diamminedichloroplatinum(ll), c/s-DDP)
> Jedno z nejúčinnějších cytostatik a nejčastěji využívaných cytostatik;
> Vykazuje klinickou účinnost proti mnoha malignitám epiteliálního původu, jako nádorům plic, hlavy a krku. močového měchýře, avšak zejména při léčbě nádorů varlat a ovariárií
•i*
OMEZENI
1) vážné nepřízivé vedlejší účinky (adverse reactions), včetně renální a gastrointestinal ní toxicity, peripherální neuropatie, asthenie apod.
2) Využitelnost k těmto cytostatikům omezuje jak „přirozená" (inherent, intrinsic), tak získaná rezistance buněk.
Biologické cíle cis-DDP (adukty cisplatina-DNA)
>Jaderná DNA -
- hlavní cíl působení cis-DDP v buňce
Viz. experimentální důkazy za posledních 30 let, (Jamieson, ER. etal., J Chem Rev, 1999)
oborciloř ytokinetiky
Aioryzikolnf ústav AVČft, BRNO
„Uptake" a cytotoxické působení cisplatiny(ll)
[CI]exs100mM
Plasma
Cytoplasma
(2) Increased Efflux
BOTES E2
H3O •
Platinum Compound
R,-NH2^ ^OHj Rj-NH2 — ^Cl
0 Decreased Diffusion
Pharmacokinetics
Nucleus
aducts
TTTTTTTTTÍ
Ba-NHa-'^NHrH
D«aguatto" "t-NHj.
■•«Sanum Rj-NHj • Species plus DNA
OH2
Ij GSH   R|^4Hj ^   ^, !=
R2-NH2
*\ 1=1 GSH
Bioassed Replicated ONA Platinum Complex
Ri-NH, „
BloduK) Replication fork
indiuny Nuiiuui ui ujui
In DNA: Apoptosia
Replicating Pt-ONA Complex
©Increi Qji*rtchtng
R Complex
RrNH,^. xR,
Rj-NH2 —^R,
atoxldty End Paint
© Increased Postrepiication Repair
- Increased Polymerase Bypass
- Decreased Mismatch Repair
PA \
Pa
©Increased Excision Reoair
Biologické „cíle" cisplatiny (adukty s DNA)
Novel Concepts in the Development of Platinum Antitumor Drugs
Curr. Med, Client, - Anti-Cancer Agents, 2002, Vol. 2, No, 4 3
Typy DNA ! aduktu
H3NV    N Hi t
—a--g—
(80-90%)
1,2 GpG Inlraf Irani)
H>\ srn
G——Vc-
H3N
,NH,
/K
--A-
-G--
1,2 GpG interstraruJ (<1%)
—T-C—
1.2 ApG intra strand (20-25%}
NK3 H-iN—R t—L
/K
—G—X—O—
1.3 GpXpG intrastrand  3 fľekVeľlC6
i-2%)      jejich výskytu
L = cr, H20, SR
-g-■c-
-x-
-Y-
můriofij notional
Fig. (2). Types of cisplatin-DNA adducts and their frequency of formation.
> Bylo ale prokázáno, že CÍS-DDP inhibuje růst
nádorových buněk v koncentracích výrazně nižších než ty, které jsou potřebné k inhibici syntézy DNA !!!!!!
> Otvírá se tak novy prostor, kde je třeba stávající „dogmata" přehodnotit a přesunout pozornost k dalším, již prokázaným, cílům působení pt-derivátů.
> Hlavní oblast těchto dalších účinků souvisíš buněčnými signalizacemi zapojenými v regulaci cytokinetiky
> To naznačuje nové možnosti cílených modulací efektů pt-cytostatik.
Cytotoxic action and molecular basis of cisplatin
ZH Siddik
Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA
B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů
LA-12?
✓ 'V NH, Cl
Cisplatin ±
DNA udducts
Dumn™e Recognition Proteins
fri-<iiisci-iptioii| Factors J
Cell Cycle ^ Checkpoints
G1,S,G2 ' Arrest
Apoptosis
Figure 1 An overview of pathways involved in mediating ci splat in -induced cellular efTects, Cell death or cell survival will depend on the relative intensity of the signals generated and the crosstalk between the pathways involved. Some of the signaling discussed in the text has been omitted for clarity
U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze) narušena.
Přispívají k tomu
změny v regulaci proteinů r. Bel, Fas,
Survivinu, Glutathionu
T
GSH--1 ApoptOSÍS
Figuře 6 Disruption of p53-dependerU apoplolic pathway in cisplaiiu-resisiaui tumor cells
Oncogene
Adamantylaminové Pt(ll) a Pt(IV)
komplexy
Dvojmocné Pt(ll) (reaktivní s DNA)
LA-9
Předpokládaná výhoda: Mpofilicita
čtyřmocné Pt(IV)
^^^[^)NA nereaktivní)
LA-12
Cispiatina (II)
JM-216
(1. z řady v klinickém zkoušení)
Syntetizované F. Žákem a spol., PLIVA - Lachema
Zak et al., 2004, J Med Chem,
Cytotoxicita Pt komplexů u CisDDP - Rezistentních nádorových linií (24hodinová kontinuální expozice)
Cancer cell line
IC50(nM)
cisDD Pt-IV
Chronic myelogenous 1 K562 >80
Chronic myelogenous KG-1 48
Acutemyelogenous ML-2 >80
Mouse mellanoma B16 >80
Colon cancer HT-29N >80
Colon cancer HT29 50
Colon cancer HCT116 >80
Lung carcinoma A427 63
Breast carcinoma HBL100 63
Breast carcinoma MCF-7 71
Lung carcinoma CORL23/CTR >80
Ovariancarcinoma A2780 4
Ovariancarcinoma A2780/cis 40
Ovariancarcinoma A2780/cis90 >80
Zák et al J.Med.Chem. 47,761-3,2004
„Dose-response" křivky (Mutest)
Nejcitlivější k cis-DDP z panelu senzitivních ovariálních buněk (H134, IGROV-1, OVCAR-3),s nejnižším % apoptózy (6-14%) (Kolfschoten, G.M. et al., Gyn. Oncol., 2002)
Získaná rezistence udržovaná přídavkem cisplatiny do kultivačního média (výsl. konc. 1 uM, každá 2. pasáž)
A2780 A27S0CÍS
Concentration [^iM]    Faktor rezistence (18:6) = 3     Concentration [|iM]
Fig. 2. Time- and close-response effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 |jlM and 256 (xM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC9o) are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates.
Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol
Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus
A2780 (siKigle staíning)
A2780
UNTREATED CONTROL CISPLATIN(50) LA-12(50)
G0/G1: 71.2 ±6.9%
GOřGI 45.5 ±6.4 %
Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol
Rozdilny vliv cis-DDP a LA-12 na bunecny cyklus
A2780cis\
A2780cis
UNTREATED CONTROL
CI3PLATIN(50)
LA-12(50)
G0/G1: 44.2 * 4.9 % S: 38 9 ±3.2% G2/M: 16.9 ±4.5%
24 hr
G0/G1: 17.9 ± 6.8 %(*) S: 66.0 ± 4.9 % (*) G2'M: 20.7 ± 6.9 %
G0/G1: 29.2 ± 5.9 %(*) S: 53.7 t 2.6 % (*#) G2/M: 19.8 ±0.8%
G0/G1: 51.1 =4.4% G0/G1: 18.4 ±10.0% (*) G0/G1: 24.3 ± 6.3 % (*)
48 hr
G0/G1: 66.3 ±5.1 % S: 23 34 ± 3.2 % G2/M: 10.4 ±2.7%
72 hr
.--■
GO/G 1:43.9 ±5.0% (*) S: 34.1 ±5.0% G2,M:21.9±2.5%(x) t
G0/G1:39.9 ±3.1 % (*) S: 37.0 ± 11.3%(*) G2/M: 27.5 ± 7.7 % (x)
Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol
Závěr: účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus se liší dynamikou a jsou u ovariárních nádorových linií lišících se rezistencí rozdílné.
Cykľm A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu);
p21, Gadd45cc („p53 target genes" - regulace b. cyklu);
Bax (apoptóza); ^ecb^H
Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklinA, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny
6 h
A2780 A2780cis
12 h
A2780 A27S0cis
24 h
A2780 A2780cis
cyclin A
Fold inciease 03     09    LG12TT
1.0 1.1 10 1.0 1.1  1.2 1.0 1.2 1.1 1.0 1.3 1.1
cdk2
Foldincrease        1.0     1.0     1.0     1.0     1.1     1.1 1.0 1.0 0.8 1.0 1.2 1.1 1.0 1.0 1.0 1.0 1.2 0.8
cyclin B1
Foldincrease        1.0     0.9     0.8     1.0     0.9     0.9 1.0 1.1 1.1  1.0 1.1  1.2 1.0 1.3 1.3  1.0 1.4 1.2
(3-actin
Nebyly pozorovány žádné změny
A2780cis
Equitoxické koncentrace cis-DDP indukují vyšší expresi proteinu p53 (teoreticky vyšší poškození DNA, než po apl. LA-12 a tudíž by cis-DDP měla působit efektivněji),
Nebylo tomu tak, tzn. že by musí existovat jiné. např. s poškozením DNA nesouvisející mechanism působení LA-12 !!!!!!
(viz i pokusy, kdy
po působení ci-DDP
dochází k poškození buněk
a k zástavě růstu
v koncentracích nižších,
které nevedou k tvorbě
aduktů s DNA)
A2780
A2780cis
(a) PARP 24 h
3kDa 89 kDa
p53
53 kDa
											
											
	0 1	cisp latin (50)	o 5'	la-12 (50)	£ ?*		control	5'	n ffl "O	la-12 (501	la-12 (90)
24h	1	0.8*	4.61 1.4*	1.61 0.1	2	24h	1	6.21 l.l*	8.21 1.(1*	2.51 0.2*	2.81 o.o-
48h	1	4 ir 1.4	6.81 1.8*	2.61 0.2	4.81 1.9*	48h	1	6.81 l.»*	6.9i 0.2*	3.21 0.5"	3.41 0.6'
72h	1	2.5± 0.6*	3.7i 0.7*	1.61 0.2	2.51 0.6*	72)i	1	5.61 2.0*	7.0± 2.8«	3.3± d.8	3.31 1.0
(d) p-actin
42 kDa
Fig. 8. Western hlot analyses of (a) PARP (upper panel) and (h) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A278()cis cells (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to IC50or IC90 concentrations of cisplatinor LA-12 and harvested at 24 h. 48 h. and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean _L S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (/> < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) (3-actin (bottom panel).
6h
A2780 A2780cis
12h
A2780 A2780CÍS
<f <r ,r ^ <r
24 h
A2780 A2780CÍS
n
p53 I-----
Folflu^iease  1.0    3.1    23    1.0    2.0    0.S 1.0 2.1 1.9 1.0 1.6 1.2 1.0 1.5 1.2 1.(1 3.2 3.0
p21 1 i.
1.0 2.2 2.1 1.0 1.6 0.9 1.0 3.5 2.9 1.0 4.6 0.8
Gadd45a
Fold increase		i		1	1.0 j.-ŕ 0.9 1.0 1.2 1.2
Mdm2	1   Illéi1				
xu-iu IlUĽlíľHídC	^U^19    1.0   1.0   0.9 1.0	1	1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0	1	1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.8
	mmm		-----		
Hledány další možné mechanismy působení
Předpoklad, že
u obou studovaných pt - cytostatik, lišících se lipofilicitou dochází významným rozdílům již v dostupnosti do buňky.
| Prokázáno
Vzhledem ke své lipofilicitě, LA-12 proniká velmi snadno do buněk
???? může reagovat s DNA a dalšími molekulami ????
NUCLEUS
NH,
V
LA-12(IV)
i reaktivita t lipofilicita (capacity factor HPLC)
rTTTTTTTTTTg
^* Zvýšený influx LA-12
(FAAS)     (19-5x u A2780; 29.3* u A2780cis) Snížená reaktita s cílovými biomol.
i
Tvoří speciální typy velkých DNA/protein aduktů nereparabilních excisiní reparací
LA-12 ttt
Replication inhibition Transcription inhibition
Naše doposud prezentované výsledky, i když plně nevysvětlují rozdíly v působení cisplatiny a LA-12, se zařazují mezi ty přístupy, které výzkum platinových cytostatik posouvají do nových oblastí.
mohou (kromě DNA) reagovat s dalšími buněčnými strukturami jako jsou např:
RNA, proteiny,
cytoskeletální filamenta, thioly- obsahující molekuly membránové fosfolipid
ené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk
Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy
- zavery-
Lipidy a zejména jejich složky vysoce nenasycené kyseliny (PUFAs), včetně jejich metabolitů eikosanoidu.
patří mezi významné epigeneticky působící faktory schopné ovlivnit jak normálních,
ale i transformovaných buněčných populací, tak proces maligní transformace.
CLoboratoř ytokineliky
MofMKÍk«lnr ústav avča. brno
Hlavní mechanismy působení PUFAs v buněčných signalizacích
1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cyto kin etiky
2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových faktorů, cytokinů a imunitní systé
3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů vznikajících peroxidací lipidů
m. woberaleř ylokineliky
niorVzikäinr úiiav nvčn, brno
Dílčí Shrnutí (teoreticko praktické dopady)
Lipidy jsou nejen významným zdrojem energie, ale představují i jedny z hlavních stavebních kamenů buněk.
Kromě strukturní úlohy (jako složky membránových fosfolipidů) je neméně podstatná řada jejich funkčních vlastností.
Změny spektra mastných kyselin (MK/VNMK) v membránových strukturách mají dopad nejen na fyzikálně-chemické vlastnosti (fluiditu, konformaci apod.), ale zejména na interakce receptoru s jejich Ugandy.
MK/VNMK tak hrají důležitou úlohu v přenosu signálů a fungují jako intra- i intercelulární mediátorv a modulátory b. signalizační sítě.
Proto patří mezi významné faktory schopné ovlivnit jak dělení a zánik normálních ale i transformovaných buněčných populací, tak proces maligní transformace.
Hlavní mechanismy působení PUFA v buněčných signalizacích
1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cytokinetiky
2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových faktorů, cytokinů a imunitní systém
3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS) vznikajících eroxidací lipidů.
Významným faktorem je množství lipidů v potravě.
Vysoké koncentrace VNMK (anebo přílišná aktivace lipidového/fosfolipidovéh
Metabolismu) mohou nepříznivě ovlivnit buněčné funkce.
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení w-3 a w-6 VNMK
(mediatory a modulátory buněčné signalizační sítě)
změny metabolismu,
n-3 PUFA
n-6 PUFA (AA, LA)
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony, | íolutantv. zářenft
Předpoklad:
lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12
by mohly být spojeny s interakcemi této látky se složkami buněčných membrán
Výsledky reflektující úvahy o potenciálním zapojení fosfolipidových struktur v mechanismech účinků pt-cytostatik
Lze vyslovit předpoklad, že u obou námi studovaných pt - cytostatik, lišících se lipofilicitou chází k významným rozdílům již v dostupnosti do buňky
Dále, je zná
k rezistenci buněk k cis-DDP může přispívat složení a distribuce fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v „seskupování" lipidů (tzv. „lipid packing", FCM, merocyanin) jsme prokázali i v našich předběžných pokusech
u buněk A2780 a A2870cis.
Naše další předběžné výsledky s využitím kalorimetrie provedené na
umělých lipozomálních strukturách naznačily:
že zatí
samy o sobě nemění vlastnosti lipozómů,
přidání AA významně mění charakter termogramu ve smyslu zvýšení membránové fluidit
Kombinace AA s cis-DDP anebo s naznačily tendence k fázové separaci
(změny nebo objevení se druhého píku),
kdy se tyto píky liší po kombinaci
i g L^^—12
i ytokinetiky
f»iofyzikální Ústav AVČR, DRNO
Vznik
suspenze vhodných polárních lipidů (např. lecithin) + působením ultrazvuku
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 DPPC + CP 1 dppc__^ j	1 1 1 1 1 1 1 1
1 fiM	
.........................	
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 TEMPERATURE (°C)
Vliv CP na DPPC multilamelární lipozómy
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 DPPC + LA12	
- 1	
6	
^ 1	
dppc_^ J	
	
1 \iM	
........................	
30 35 40 45
TEMPERATURE (°C)
Vliv
na DPPC
Rozdíly cisplatina (CP) vs
jj
Cit
30        35        40 45 TEMPERATURE (°C)
Po 50|iM AA pozorujeme snížení píku odpovídajcího předpřechodu a zároveň rozšiřování hlavního fázového přechodu -_z
přičemž se entalpie přechodu nemění.
30        35        40 45 TEMPERATURE fC)
je zřejmé, že tendence změny je podobná jako po AA.
i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i (DPPC + 100nMAA) + CP
i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i
25        30        35        40        45 50 TEMPERATURE (°C)
(DPPC + 100 ]M AA) + LA12
30        35        40 45 TEMPERATURE ("C)
I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i (DPPC + 100 lM DHA) + LA 12
30 35 40 45
TEMPERATURE ("C)
Naše další předběžné výsledky naznačily
(provedené na umělých lipozomálních strukturách využitím kalorimetrie
že zatímco ani cisDDP ani L A-12 samy o sobě nemění vlastnosti lipozómů, přidání AA významně mění charakter termogramu ve smyslu zvýšení membránové fluidity.
Kombinace AA s cis-DDP anebo s L A-12 naznačily tendence k fázové separaci
'-tměny nebo objevení se druhého píku).
ýto píky se po kombinaci AA s cis-DDP vs. AA s LA-12 liš
Je známo
že k rezistenci buněk k cis-DDP může přispívat složení a distribuce fosfolipidových komponenty membránách.
Významné rozdílnosti v „seskupování" lipidů
tzv.Jipid packing", FCM, merocyanin - váže se na „rozvolněnou" strukturu lipidů (zvýšení flurescence) - cca odráží míru fluidity
jsme prokázali i v předběžných pokusech
u nádorových buněk ovarií A2780 a A2870cis (se získanou rezistencí).
Dynamický charakter biologických membrán (model)
Pietzsch J et al., Náture Reviews, October 2004
Glycosylphosphatidyllnositol (GPI)
Zajištění většiny biologických funkcí se neobejde bez unikátních interakcí
lipidových komponent1) s dalšími biologicky významnými molekulami.
Jejich modulace mohou významně měnit intenzitu a také směr sign. transdukce
kátních interakcí molekulami.
Eittrac ellular Fluid
Carbohydrate
Glycoprotein
Integral protein
Filaments of cytoskeleton
Cytoplasm
Pokrok v pochopení významu struktur obsahujících lipidy
(např. tzv. lipidových raftů - membránových lipidových mikrodomén obohacených o glykosfingolipidy a cholesterol)
závisí na rozvoji metodologií orientovaných na poznání struktury a funkce těchto, ale i jiných unikátních uskupení, jejichž modulace mohou významně měnit intenzitu a také směr signálové transdukce.
CLaboratoř Vlokineliky
Biofyzikálni ústav AVČH. BRNO
LA-12 indukuje „upregulaci" proteinů DR5, mRNA a zvyšuje
zastoupení DR5 v lipidových raftech
Zastoupení DR5 a DR4 v membránách
S 5 U
> 4 j;
c
o 3
f. <r.
* 2
Q.
K
O -
DC
Q
o
■ DR4
□ DR5
cisplatin (::M) LA-12 (//M)
1.5
0.1 0.5 1
cisplatin LA-12
- HCT116 -
Celkové hladiny DR5
LA-12 (vM)
0.1   0.5    1 2.5
Celkové zastoupení DR5 (rafty)	
2.0-	
1.5 g o ° 1 o TJ •2 0.5 0 cisplatin LA-12	* * III + +
control
cisplatin
LA-12
Lokalizace DR5 v lipidových raftech
Olga Vondálová Blanářová, Arpád Szóór, Iva Jelínková, Bělma Skender, Karel Souček, Viktor Horváth, Alena Vaculová, Ladislav Anděra,Petr Sova, Jánoš Szóllósi, Jiřina Hofmanová, Gyórgy Vereb, and Alois Kozubík
Cisplatin and a potent platinum(IV) complex-mediated enhancement of TRAIL-induced cancer cells killing is associated with modulation of upstream events in the extrinsic apoptotic pathway
Carcinogenesis: 32(1), 42-51, 2011
Studie in vitro:
(Machala)
Žák F., Turánek J., Kroutil A., Sova P., Mistr A., Poulová A., Mikolin P., Žák Z., Kašna A, Záluská D., Neča J., Šindlerová L., Kozubík A.:
Platinum(IV) complex with adamantylamine as nonleaving amine group: synthesis, characterization, and in vitro antitumor activity against a panel of cisplatin-resistant cancer cell lines.
J. Med. Chem. 2004 Jan 29; 47(3):761-3.
Turánek J., Kašna A., Neča J., Kvardová V., Knótigová P., Záluská D., Horváth V., Šindlerová L., Kozubík A., Sova P., Kroutil A, Žák F., Mistr A:
New platinum (IV) complex with adamantylamine Ugand as a promissing anticancer drug: Comparison of in vitro cytotoxic potential towards A2780/cisR cisplatin-resistant cell line within homologous series of platinum (IV) complexes. Anticancer Drugs. 2004; 15:537-543.
Kozubík A., Horváth V., Švihálková-Šindlerová L., Souček K., Hofmanová J., Sova P., Kroutil A, Žák, F., Mistr, A.,Turánek J.:
High effectiveness of platinum(IV) complex with adamantylamine in overcoming resistance to cisplatin and supressing proliferation of ovarian cancer cells in vitro. Biochem. Pharmacol. 2005; 69:373-383.
Horváth V., Blanářová, O., Švihálková-Šindlerová L., Souček K., Hofmanová J., Sova P., Kroutil A., Kozubík A.,.:
Platinum(IV) complex with adamantylamine overcomes intrinsic resistance to cisplatin in
ovarian cancer cells.
Gynecol. Oncol. 2006; 102:32-40
Studie in vivo
Sova P, Mistr A, Kroutil A, Zak F, Poučková P, Zad i nova M.: Preclinical anti-tumor activity of a new oral platinum(IV) drug LA-12. Anticancer Drugs. 2005;16:653-7.
Sova P, Chládek J, Zak F, Mistr A, Kroutil A, Semerad M, Slovak Z.: Pharmacokinetics and tissue distribution of platinum in rats following single and multiple
oral doses of LA-12 [(OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylamine)amminedichloroplatinum(IV)]. Int. J. Pharm. 2005;288:123-9.
Cermanova J, Chládek J, Soval P, Kroutil A, Semerad M, Beránkova Z, Široký P, Surova I.:
Single-dose pharmacokinetics of a novel oral platinum cytostatic drug ([OC-6-43]-bis[acetato][ 1-adamantylamine]amminedichloroplatinum [IV]) in pigs. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2004; 26:679-85.
Ukončena 1. fáze klinického hodnocení
Tyto výsledky naznačují, že
1) změny fosfolipidového metabolismu by mohly souviset s rezistencí nádorových buněk k cis-DDP
2) signální dráhy zahrnují fosfolipidové komponenty by mohly být součástí mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA
Proto cílená modulace fosfolipidového metabolismu,
(založená např. na využití speciálních lipidových výživ)
by mohla být jednou z nových strategií vedoucích k posílení účinků pt-cytostatik
Podstata návrhu projektu
TREATMENT
Environmental pollutants
(PAHs, PCBs; TCDD)
PUFAs Cytokines
(TGFß i TNF-a)
membrane -►cytoplasm -►nucleus (SIGNALING PATHWAYS)
EFFECTS
\
/
imbalance of prooxidative/ antioxidative processes
imbalance at the level of PUFA metabolism
apoptosis
cell cycle and proliferation
		
>		»
o		
the	tion	et i c
		
cg		
0	CI	0
nc	o	
		
	o	
CO		0
		
o-
ciberciler ytokinetiky
Riofyzikälní ústav nvČR, ARNO
Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA
Lipidové výživy vhodného složení
PERIMENTALNI OVLIVNĚNÍ
PUFAs
cisplatina
cytostatika
nové
generace (LA-12)
„přenos signálů" membrána-cytosol-jádro
UCINEK
zmeny fluidity membrán
lil
O
poškození cytoskeletu, oxidatívni stres...
lil I-
■LU
<
N HI
apoptóza
buněčný cyklus a proliferace
d) o
d)
o >,
o
Podstata možných návrhů projektů - prozatím neuzavřeno
Další možné cíle
Studium molekulárních mechanismů odpovědných za apoptózu indukovanou platinovými cytostatiky a
TRAIL
• Úloha vybraných proteinů zodpovědných za
prokázanou potenciaci apoptózy po kombinovaném působení LA-12/ TRAIL
(p53, NF-kappaB, iniciační a efektorové caspázy, inhibitory endogenních caspas, rodina proteinů Bcí-2 proteinů atd.)
• Sledování kombinovaného působení Pt cytostatik a TRAIL na buňky odvozených z dalších typů nádorů a na normální buňky
• Srovnání efektů LA-12 a dalších konvenčně užívaných platinových cytostatik
et al.)
LA-12 nebo cisplatina posilují cytotoxické působení TRAILu u nádorových buněk kolonu a prostaty
HCT-116 LA-12/cDDP 24 h, TRAIL 24 h
I-,-,-,-,-1 0.0   H— —r- I
70 75 80 85 90 95 70 75 80 85 90 95
Time (h) Time (h)
Podobné výsledky získány i u PC3 buněk
Předpokládané interakce složek diety a endogenních regulátorů cytokinetiky epiteliálních buněk kolonu
GUT-LUMEN-i-1
DIETARY PUFAs DIETARY
Kovaříková M. et al. Eur J Cancer 2000 Kovaříková M. et al. Differentiation 2004 Hýžďalová M. et al. Cytokine 2008
Hofmanová J. et a. Eur J Nutr 2005 Hofmanová J. et al. Cancer Letters 2005 Vaculová A. et al. Cancer Letters 2005 Hofmanová J. et al. Mol Nutr Food Res 2009
Buněčné línie
fetální colon FHC
adenomy AA/C1
RG/C2
adenocarcinomy s^
HT-29 C
C
HCT116 Ss
o
c <
lymf. g í
metastáza nt q SW-620     ° °
Hyper-proliferation
Early Adenoma
Intermediate Adenoma
Late Adenoma
Carcinoma
Metastases
Inhibiční účinky butyrátu
Stimulation of proliferation in the basal crypt
Inhibition of proliferation in the upper crypt
Induction of apoptosif
Inhibition of proliferation Stimulation of differentiation
ition
Hypcracctylation of histoncs
Alterations in gene expression effects on extracellular matrix
Regression of carcinomatosis in vivo
(acetate, propionate, bury rate)
(butyrate)
(butyrate)
{butyrate, propionate) (butyrate)
(butyrate) (butyrate)
(interleukin-2 + butyrate)
A A (50m M)
Roslinné oleje
DHA
Rybí oleje
Endogenní regulátory NaBt(3mM)TRA|L5 TNFa, ■
Vlákina   anťl.FaS Receptory!
smrti
FAT/CD36 A DR4,DR5 ■
fBi nn CD95
Plasmatická membrána
Cytoplas
Metody využívané na různých úrovních buněčné oraganizace
plasmatická membrána
Lipid packing
flow cytometrie (merocyanin 54C,'
Lipidové analýzy Phospholipidy (LC-MS) Zastoupení M K (GC-MS)
cytoplasma
Lipid droplets flow cytometrie -Nile Red
i—~—:-r.—i
ROS - flow cytometrie (DHR-123) MM P -flow cytometrie (TMRE) Bcl-2 rodina (Western blotting)
-►    Transcriptční faktory, genová exprese
Proliferace Diferenciace Apoptóza
PPsiE
PUFAs (AA, DHA) zvyšují citlivost nádorových buněk kolonu k apoptóze indukované butyrátem nebo cytokiny rodiny TNF
EurJ Nutr(2005) 44:40-51 Odl 10.1007/500394-004-0490-2
ORIGINAL CONTRIBUTION
DOI 10. IDOa'mrifľ.IMKulTí-
Research Article
Human fetal colon cells and colon cancer cells respond differently to butyrateand PUFAs
Jiřina Hofmanová, Alena Vaculová, Zuzana Koubková, Martina Hýžďalová and Alois Kozubik
Available online at www.sciencedirect.Km
SCIINCl^DlIttOT*
ELSEVIER
Cancer Letten 22*1 pUB) 43-4»
lir ilia Hofmanová Alena Vaculová Antonín Lojek Alois Kozubík
Interaction of polyunsaturated fatty acids
and sodium butyrate during apoptosis
in HT-29 human colon adenocarcinoma cells
Mol. Nutr. Food Rbs.2009, S3, S102-S113
TRAIL and docosahexaenoic acid cooperate to induce HT-29 colon cancer cell death
Alena Vaculová11, Jiřina Hofmanová*1, Ladislav Andcrab, Alois KozubíkJ
Laboratoř? aj C\to!nneticsT Institute of Biophysics. Academy of Sciences of the C&ch Republic, KrdlovopoisJta' }35.bt2 65 Srno. Czech Republic bLabotaíory of Ceil Signalling and Apoptosis, Institute of Moist uiai frenetics. Vídenská 1WÍ3, 142 20 Praha 4, Czech Rej
Received ft NavcmlKr 2M4: received in revised form 10 Dcccmbcr^M: accepted LJJ DcccmlKr 2CJCÍ4
Polyunsaturated fatty acids sensitize human colon adenocarcinoma HT-29 cells to death receptor-mediated apoptosis
Jičína Hofmanová*, Alena Vaculová, Alois Kozubik
Laboratory ^Qiotintdc* f ITI j 'ij ■! ■ I  ■ fmij  j" T i ■■ ■■ efjht CaceA Jh/MiUk-. KrUtnafaliltAíäS.
:><:..<- : ■■: ■
haľävod H 3moĚ         received BmiiBj tam M ktfy 2ffit^ ieeeBfled24 ktty 2CŮ4
ONCOLOGY REPORTS 19: 567-573, 2008
Response of normal and colon cancer epithelial cells to TNF-family apoptotic inducers
JIŘINA HOFMANOVÁ, ALENA VACULOVÁ*, MARTINA HYZDALOVÁ* and ALOIS KOZUBÍK
Laboratory of Cyrokincrics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.vi., Královopolská 135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic
Užití
Výr o
Výzkum
(vývoj)
Í) X
Aplikovaný (cílený)
Základní
m. woberaleř ylokineliky
niorVzikäinr úiiav nvčn, brno