yziologie buněčných systémů (proliferace, diferenciace)
A. Kozubík
Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělenícytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU
{Oddělení fyziologie a imunologie živočichů)
Brno
Diferenciace
Figure 7-3. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
Differs/] csš )n ihs prai^í/js ^ipr^ss^d by v/jd
(A) human brain (B) human liver
— ■ ■
acidic    isoelectric point basic
Figure 7-4. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
Polyklonální charakter kostních buněk
Přirovnání kmenové buňky ke stromu:
a - kmenová buňka v embryonální podobě b - kmenová buňka v dospělosti
Buněčné komponenty hematopoetického mikroprostředí (H.I.M.) v kostní dřeni
(podle Knospe 1978)
Buněčný typ	předpokládaná funkce
Endotelie sinusoidu	zachycování kmenových buněk, výměna metaboitu uvolňování zralých buněk do cirkulace, část mikroprostředí umožňující buněčnou proliferaci
Fibroblasty	tvorba kolagenu, mukopolysacharicfi, indukce diferenciace?
Tukové buňky	vyplení prostoru po zaniklé kostní dřeni,
Retikuloendotelové buňky, nonocyty	proliferace pluripotentních kmenových buněk fagocytóza, tvorba CSF a jiných hemokininů indukce diferenciace'
Endostální buňky	tvorba CSF a jiných hemokininů kmenové buňky stromatu?
Kost	mechanická ochrana, tvorba hemokininů?
LYlVJFOPOÉZA
Kostní dřeň PiíJiVIÁRNlLXK
Thymus -"thymové hormony"
SEKUNDÁRNÍ (Lymfatické uzliny a slezina)
(§)©©(§)
O
/ \ © Ä
Primární imunitní odpověď
©
/ \
Sekundární imunitní odpověď
®
®
Recirkulující paměťové buňky s dlouhou dobou života T- lymfocyty
Plazmatická buňka B lymfocyty
The early acting growth factor which maximises host defense
iL
Myeloid Stem Cell
GM-CSF
IL-3
Proerythroblast Megakaryocyte
I EPO
©
Neutrophilic Myelocyte
I GM-CSF IC-CSF
Platelets
Polymorpho-
nucleated
Neutrophil
Promonocyte
GM-CSF
Im-csf
Monocyte
I GM-CSF
1m-csf
Eosinophilic Myelocyte
IGM-CSF jlL-5
Eosinophil
Macrophage
IL-3/IL-4
Myeloblast
IL-3/IL-4
Maat Can
>0>
c
13
I
>? -í
>s= -Ä -i
i
s
100 %r
50% -
CFU-S
0%
"Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii
i
BFU-E CFU-E CFU-C
CFU-eozinofilů CFU-Meg CFU-makrofágů2 CFU-BL3 CFU-TL3
' erytroblasty myelocyty megakaryocyty
M O T3
B
(Ľ>
)!-H
Ph
Pluripotentní buňky
Morfologicky rozpoznatelné buňky
--►
Proliferující buňky NeptolifferajM
1 Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2podle Mac\ittieho a Porvaznika (1978); 3nejsou odvozeny od CFU-S.
Obr. 23. Na obrázku je znázorněna zvýšená proliferace při erytropoetic-kém stresu, která může vést k značné expanzi kompartmentu progenitoro-vých erytroidních kmenových buněk. Citlivost k erytropoetinu (EP) se objevuje až v pozdějších stádiích. Upraveno podle Schofielda a Lajthy (1977)
CFU-K
rj r1 i r n
✓ 1 ✓ i ✓ ■
✓ i
Progenitorové
CFU-E
Kmenová ^ buňka /
#
\
citlivé na erytropoetin
citlivé na CBF
citlivé na JL3
o
Obr.27. Model humorálního řízení hemopoézy. Nejnezralejší buňky obsahují receptory*    í&kloí&ii] íi320ykiýiil íia difížřSliCiaiSJ jednotlivých řad, jako je ILj. Při maturaci se postupně tyto receptory ztrácejí a objevují se specifické receptory pro humorální faktory jednotlivých řad [pro erytropoetin (▼) a pro     p (▼) ]. Podle Iscova (1978)
Polyklonální charakter kostních buněk -
Přirovnání kmenové buňky ke stromu:
a - kmenová buňka v embryonální podobě b - kmenová buňka v dospělosti
Fig.  1 . Attra cto r concept for trie description  of cellular states and different levels of variability. <A.)A three-dimensional illustration of
an attractor landscape. "The valleys represent stable stationary states <i.e. i^tpnemi36,s25^530(2HB>
attractors) generated  t>y a hypothetical  regulatory network. Depending
on the particular configuration of the network (e.g.  different parameter
values, such as transcription or decay rates), a different number and/or
different qualities of attractors are possible. ( B-P) Selected attractor
configurations <i.e.  cross—sections of the given landscape) with
corresponding variance components. (B > /X single attractor,
characterised by a small degree of potential fluctuations i n, «sr Mi 11 ~i r
characteristics within the attractor ('microheterogeneity'). KCyiwa
r^ic (      .-. 11 > I <^     M i       I < > r ■.   "This configuration allows for heterogeneity within
attractors and for potential exchange between the attractors
t*macroheterogeneity'>. <P)Two separated attractors.  CZells are trapped
in one of the two possible attractors and cannot exchange between
them.   However, a third  level of heterogeneity (illustrated  by the blue
arrow) corresponds to potential changes in the attractor landscape
itself. "This can be achieved by changes in the configuration (e.g. the
parameter values) of the network, even without changing the
structure/topology of the network.
Attractor „cílový" pohyb
Limita
je matematická konstrukce, vyjadřující, že se hodnoty zadané posloupnosti nebo funkce blíží libovolně blízko k nějakému bodu.
Právě tento bod je pak označován jako limita.
Trajektorie
souvislá čára, kterou hmotný bod při svém pohybu opisuje,
se nazývá trajektorie hmotného bodu.
Atraktory - vizualizace
Jedním způsobem vizualizace chaotického pohybu, nebo opravdu libovolného typu pohybu, je vytvoření fázového diagramu pohybu.
někdo kreslí pozici kyvadla vůči jeho rychlosti.
Kyvadlo v klidu bude zobrazeno jako bod a kyvadlo v periodickém pohybu
bude nakresleno jako jednoduchá uzavřená křivka.
Když takový graf vytváří, uzavřenou křivku, křivka se nazývá orbita.
Lorenzův atraktor popisuje pohyb systému ve stavovém prostoru.
V matematice a fyzice se teorie chaosu zabývá chováním jistých nelineárních dynamických systémů, které (za jistých podmínek) vykazují jev známý jako deterministický chaos, nejvýznamněji charakterizovaný citlivostí na počáteční podmínky (viz motýlí efekt). Malá změna v počátečních podmínkách vede po čase k velmi odlišnému výsledku.
V důsledku této citlivosti se chování těchto fyzikálních systémů, vykazujících chaos, jeví jako náhodné, i když model systému je
deterministický v tom smyslu, že je dobře definovaný a neobsahuje žádné náhodné parametry.
Příklady takových systémů zahrnují atmosféru, solární systém, tektoniku zemských desek, turbulenci tekutin, ekonomii, vývoj populace.
Systémy, které vykazují deterministický chaos, jsou v jistém smyslu složitě uspořádané.
Tím je význam slova v matematice a fyzice v jistém nesouladu s obvyklým chápáním slova chaos jako totálního nepořádku. Původ tohoto slova lze najít v řecké mytologii - viz chaos.
Chaotický pohyb
Abychom mohli klasifikovat chování systému jako chaotické musí
musí být citlivý na počáteční podmínky
musí být topologicky tranzitivní jeho periodické 'i husté
Citlivost k počátečním podmínkám znamená, že dvě blízké trajektorie ve fázovém prostoru se s rostoucím časem rozbíhají (exponenciálně).
Systém se chová identicky pouze když jeho počáteční konfigurace je úplně stejná. Již při malých diferencích toto neplatí.
Příkladem takové citlivosti je tzv které ale v průběhu času mohou vést až k tak dramatickým změnám, jako je výskyt tornáda Mávnutí křídel motýla zde představuje malou změnu počátečních podmínek systému, která ale
způsobí řetěz událostí vedoucí k rozsáhlým jevům jako jsou tornáda. Kdyby motýl nemávl svými křídly, trajektorie systému by mohla být zcela odlišná.
Stem cell biology meets <-
systems biology
lngoRoeder1r* and Fraddy Radtke3 □wrelnpniait 136. 3S35-3530 pOBJ
Atraktor většina stavových trajektorií (drah hmotného bodu) se přibližuje a „obmotává" nějakou obecnou limitu.
Systém končí ve stejném pohybu pro všechny
počáteční stavy v oblasti okolo tohoto pohybu,
téměř jako by byl systém k tomuto pohybu
(trajektorii fázového prostoru) přitahován (anglicky 'attracteď).
Six steps at which eucaryotic gene expression can be controlled
	RNA
DNA	„ transcript
NUCLEUS
mRNA
inactive mRNA
CYTOSOL mRNA
degradation 5 control
mRNA:
1
transcriptional control
2
RNA
processing control
3
RNA transport
and localization control
translation . protein control     4 activity
control
♦ 6 _
protein      ■ inactive protein
Figure 7-5. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
Děje v buněčné diferenciaci
6.
7.
growth factors receptor
kinases/2nd messengers
later
(T=ŕ„
regulators
genes
1
<L hn
RNA
t
mRNA
8.    amino acids
proteins
15. (enzymes)
cell
nucleus
replitase
18. cytokinesis
Spolupůsobení
„regulátorů růstu" rozdílné chemické povahy
a
regulace PROLIFERACE
(příklady)
The four imp^teyjit families of organic molecules in cells
building blocks of the cell
SUGARS
FATTY ACIDS
AMINO ACIDS NUCLEOTIDES
larger units of the cell
POLYSACCHARIDES
FATS, LIPIDS, MEMBRANES~|
-i =1
PROTEINS NUCLEIC ACIDS
Figure 2-17. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
SPOLEČNÉ CHARAKTERISTIKY CYTOKINŮ
Přestože cytokiny představují velmi heterogenní skupinu proteinů, lze uvést některé jejich společné charakteristiky:
1) Nízká MW (< 80 kDa), často bývají glykosylovány (glykoproteiny)
2) účastní se imunity a zánětu, kde regulují intenzitu a délku trvání odpovědi
3) jsou produkovány - lokálně, po přechodnou dobu
4) působí spíše autokrinně a parakrinně
5) jsou vysoce účinné (pM)
6) interagují vysoce specificky s povrchovými receptory
7) po vazbě na receptory indukují syntézu mRNA a receptorových proteinů
8) působí v síti, kde
I- svoje efekty vzájemně ovlivňují (zejm. svoji produkci) - indukují transmodulaci povrchových receptoru - mohou působit na buněčné funkce aditivně, synergicky anebo antagonistický
PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH CYTOKINŮ - 2.
cytokin zdroj
IFN a 1  dvojitě negativní IFN a 2 lymfocyty, monocyty, makrofágy
působení
zvyšuje rezistenci proti virům; inhibuje proliferaci normálních i nádorových buněk; indukuje syntézu MHC I, receptoru pro Ig; aktivuje NK-buňky
IFN p 2 fibroblasty, monocyty
stejně jako u IFN a
TNF a makrofágy, T-buňky, thymocyty, B-buňky, NK-buňky
působí nekrózu různých typů buněk, převážně nádorových; pleiotropní účinky na široké spektrum buněk, např. reguluje proliferační a funkční odpověď B- a T-buněk; stimuluje diferenciaci prekurzorů myeloidní řady; stimuluje expresi cytokin, MHC a prostaglandinů
G-CSF  monocyty, makrofágy, T-buňky, fibroblasty, buňky endotelu
stimuluje proliferaci kolonií granulocytů; aktivuje granulocyty
M-CSF  monocyty, makrofágy,       stimuluje růst kolonií monocytů a makrofágů; aktivuje monocyty fibroblasty
TGF p   krevní destičky, kosti -       reguluje růst buněk (většinou inhibuje proliferaci vyvolanou matrix, placenta, ledviny,    působením hematopoietických cytokinů) některé nádory
PŘEHLED NEJDULEZITEJSICH CYTOKINU -1.
cytokin zdroj
IL -1     monocyty (+ téměř všechny buňky s jádrem)
působení
pyrogen, komitogenní faktor T-buněk; stimuluje uvolnění lymfokinů T-buňkami; aktivuje NK-buňky;stimuluje diferenciaci B-buněk
IL - 3     T-buňky (+ žírné buňky)
stimuluje proliferaci prekurzorů granulocytů, erytrocytu, megakaryocytú, makrofágů; aktivuje monocyty a makrofágy
IL - 5 T-buňky
stimuluje diferenciaci a růst eozinofilů, proliferaci T- a B-buněk
IL - 7    buňky kostní dřeně stimuluje proliferaci prekurzorů B- a T-buněk a T-buněk
IL - 9
monocyty, makrofágy, lymfocyty, fibroblasty, buňky endotelu T-buňky
stimuluje proliferaci T-buněk bez přítomnosti antigénu a APC
IL -11    buňky kostní dřeně
stimuluje proliferaci multipotentních prekurzorů leukocytu (synergie s IFN y) a prekurzorů megakaryocytú (synergie s IL - 3)
cytokiny jsou polyfunkční
G-CSF
G-CSF
multi
■CSF     I Gl
GM-CSF
M-CSF
SCF.....>
GM progenitor cell
++
€)€)€) <Q<Q<Q <Q<Q
GM progenitor cell
<Q<Q <Q<Q
mature granulocytes
mature granulocytes
© ©
mature macrophages
G-CSF
i
□
i
G-CSF
myeloblast
i
mature granulocyte
mature granulocyte
v 4| superoxide
phagocytosis
Úloha IL - 1 v hematopoéze
1. monocyte production and activation
2. proliferation of committed progenitor cells (BFU-E, CFU-GM)
clonal expansion of differentiated B - cells
IL-1
T-cells endothelial cells
fibroblasts epithelial cells
1. T - cell growth
2. Ig secretion
1. neutrophil activation
2. neutrophil production
3. stem cell activation
adhesion of leukocytes to other cells
ELAM - endothelial leukocyte adhesive molecule ICAM - intercellular adhesive molecule
„Network" interakcí cytokinů
IL-4
Antibody
Bone marrow
Autoregulace uvnitř systému granulocytů - makrofágů
CFU-C (GM - CFC)
CFU - C CFU - C CFU - C
o ..-o
A-
CSF \«-     CSF     /   PGE2 /   \    \ CSF /   \     \ CSF
0 ©   \0 ,0 030
ABC
různé koncentrace CSF       zpětnovazebná stimulace —>       produkce inhibitoru
a inhibice PGE--> tvorby CSF
G - granulocyty   M - makrofágy
Oncogenes
Growth factor
fgf-5 sis
G protein
rab ras ral
Tyrosine kinase
abl
erb
B2/neu
fes/fps
fgr
fyn
kit
Ick
met ret sea src trk yes
Serine kinase
mil/raf pks mos raf pim-1 rel
Nuclear
fos myc jun ski mvb_
Transducer
Effector
2nd messenger
Target
		Growth factor
Receptor bek fms erb B mas fka ros		
		Receptor
		
		
Receptor_ Receptoj^_ ReceptoL G protein
Receptor
I
G protein |> i ^
.Receptor_ PLGy tyrosine^-—-*'
kinase
Regulatory proteins
G protein
_PLA2_Na+/H _ AdenylyL_m
y A Y      antiport cyclase
/\ Arachidc -
DG IP.^JCa-r   G   -    [pH], CAMP-^
PKC PK (?) Calmodulin j PKA " _Í_Jr_±_>l >
Arachidonate     I I
/A    1 1
RNA/protein synthesis
DNA synthesis
c
o
r-m
According to: G.Powis: TiPS; 12: 188-194, 1991
Nutrient/GF Deprivation ?Heat
Mitogens Growth Factors Hormones Serum
Environmental Stress UV light Ionizing Radiation Chemotherapy Xenobiotics 02, TM, Heat
c-jun, c-fos antioxidants
p53
c-Ablf	1 ku
	
	MDM
1	
GADD45	P21-1	PCNA ran 1 j r*at 1 n n
		IC?|JIIUClUUl 1
1 RbE2F	Rb-Pi Ce2F)	
	t ^	
c-Abl
Replication
Cytokines Fas-ligand TNF-alpha
Apoptosis
According to: Rizzieri: Drug Resistance Updates; 1: 359 - 376, 1998
c
ßiofyiikäli
Qler ttiky
CR, BRNO
Factor 1 - concentration
An example of interactions of two factors (data from Eur. J. Pharmacol. 316, 349-357, 1996, see Publications.)
I. dodáním exogénni kyselimy arachidonové
(AA)
I. ovlivněním produkce eikosanoidů s využitím inhibitorů:
L PO nebo CO nebo P450
t
TGF-pV TNFa		^^FJ^TOF^	
			/
po indukci do:
granulocytů nebo
monocytů -makrofágů
diferenciace
proliferace
atiotitóza (nekrózaj
to
čas (t)
Vy
a c
t
ytvoření souboru dat detekcí proliferace, diferenciac apoptózv u buněk v definovaných časových intervale
T
dat
ice ech
Zhod,
;h interak(
loanoceni aat: vymezeni vyznamnycn mteraKci
pomocí matematické analýzy dat í modelových
ítailt
STRUKTURNÍ ÚLOHA
NEODDĚLITELNÁ OD BUNĚČNÝCH FUNKCI
Kompartmenty
funkčně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek).
DŮSledek kOmpartmentaCe(existence jednotlivých kompartmentů) prvky (např. látky nebo buňky) jsou nerovnoměrně rozděleny.
Příklady:
všechny membránami ohraničené struktury mají (z hlediska rozdělení látek) „své vnitřní
prostředí" a selektivně akumulují nebo zadržují určité látky proti koncentračnímu spádu.
Už tímto prostým faktem jsou některé reakce umožněny jiným může být zabráněno.
Tato protientropíCká distribuce molekul v bu ňce směřující proti neuspořádanosti má velký význam pro buněčný metabolismus a regulace.
Umožňuj e j i právě
existence buněčných membrán -jeden ze zakladl biologických systémů Bude rozvedeno později
Přirozené funkce membránových lipidu
funkční
strukturní
(REGULAČNÍ)
růstové signály
ftiofyzikóln
SIGNAL (e.g. cytokines)
proteins
membrane phospholipids
nuclear receptors transcription factors (NFkB. PPAR. AP-1-)
/
3 PUFAs
inhibition (NSAIDs)
dietary n-6 PUFAs (AA. LA)
arachidonic acid
exfacellular stimuli (cytokines, hormonps, pollutants, irradiation)
CYCLOOXYGENASE S
PGG
IPGH
MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLAo
TXA,
PGI,
PGD
PGEJ
TXBc
OH
I
COOH
EPOXYGENASES
LIPOXYGENASE
A.
PGE,
COOH
' S CH2
g85DNHCH2 NH
COCH2CH2CHCOOH NH,
OH
Signal transmission systems
HI
i
ATP        CAM P
IP3
arachidonic acid (AA)
receptor
G-protein
prostaglandins (PG)
leukotrienes
positive effect on cell proliferation- an example
rotor
win. BRNO
Negative effect on cell proliferation- an example
GO
G1
cell cycle phases I
63
XXXXXXDd
jCXXXXXXj
SIGNAL 1
Ca2+
Ptdlns(4,5)P2
ooooooooooooooooo
PC
Phospholipase C     Phospholipase A2
Phospholipase D
lns(1A5)P.
DAG
Ca2+
F FA			LvsoPC	
				
DAG
Transient PKC activation    Sustained PKC activation
J L
I
Early responses e.g. Secretion Release reaction
T
QC
Late responses e.g. Proliferation Differentiation
Protein kinázy a fosphatázy
Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations
MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS
INDOMETHACII f DICLOPHENAC
If
	---------	
-	—	ETYA
		
CYCLOOXYGENASES
SKF525A, 9-HE
PROSTAGLANDINS
THROMBOXANE
PROSTACYCLIN S
I
TYA   = 5,8,11,14-eicosatetraynoic cid ESC     = esculetin DGA   = nordihydroguaiaretic acid LAP    = 5-lipoxygenase activating rotein 9-HE     = 9-hydroxyellipticin ETEs   = hydroxyeicosatetraenoic acids PETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic cids EETs poxyeicosatrienoic acids
12-LIPOXYGENASE
12-HETEs 12-HPETEs
P450-MONOOXYGENASES
5-LIPOXYGENASE
LEUKOTRIENES
(
*
EETs HETEs DIOLS
■
FLAP
/
MK- 886
(15 -LIPOXYGENASE)
Figure 1
koncentrace (\xM) koncentrace (jj.M)
effect
TGF-ßl
lipoxygenase inhibitors differentiation agents + (MK886, esculetin)       + (TPA, RA, DMSO)
cell membrane
induction of differentiation
inhibition of proliferation
cell cycle turnover
unknown
well documented
nierVziköli
'cilor
i», IMMO
MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS
FLAP
MK-886
(15- LIPOXYGENASE)
o
growth factors hormones
receptor
	
	PLA2 —'
AAAAAAAA
PLA
cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases
eicosanoids
-ion channel activity
- guanylate cyclase
- adenylate cyclase
- protein kinase C
- protein kinase A
- tyrosine kinase
- MAP kinase
- G-proteins
transcription factors
i
gene expression cell growth
According to: A. Seilmayer et al.
Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ;
57:353-357,1997.